1.新生儿期筛查新生儿喂奶3日后，采集足跟末梢血，吸收再生厚滤纸上，晾干后邮寄到筛查中心，采用Guthrie细菌生长抑制试验半定量测定，其原理是苯丙氨酸能促进已被抑制的枯草杆菌重新生长，以生长圈的范围测定血中苯病氨酸的含量，亦可在苯丙氨酸脱氢酶的作用下进行比色定量测定，其假阳性率较低。当苯丙氨酸含 量>0.24mmol/L(4mg/dl)即两倍于正常参考值时，应复查或采静脉血定量测定苯丙氨酸和酪氨酸。正常人苯丙氨酸浓度为0.06～0.18mmol/L(1～3mg/dl)而无患儿血浆苯丙氨酸可高达1.2mmol/L(20mg/dl)以上，且血中酪氨酸正常或稍低。
2.尿三氯化铁试验用于较大婴儿和儿童的筛查。将三氯化铁滴入尿液，如立即出现绿色反应，则为阳性，表明尿中苯丙氨酸浓度增高。此外，二硝基苯肼试验也可以测尿中苯丙氨酸，黄色沉淀为阳性。
3.血浆氨基酸分析和尿液有机酸分析可为本病提供生化诊断依据，同时，也可鉴别其他的氨基酸、有机酸代谢病。
4.尿蝶呤分析应用高压液相层析测定尿液中新蝶呤和生物蝶呤的含量，用以鉴别各型PKU。典型PKU患儿尿中蝶呤总排出量增高，新蝶呤与生物蝶呤比值正常。DHPR缺乏的患儿蝶呤总排出量增加，四氢生物蝶呤减少，6-PTS缺乏的患儿则新蝶呤排出量增加，其与生物蝶呤的比值增高，GTP-CH缺乏的患儿其蝶呤总排出量减少。
5.酶学诊断PAH仅存在于肝细胞，需经肝活检测定，不适用于临床诊断。其他3种酶的活性可采用外周血中红、白细胞或皮肤成纤维细胞测定。
