心脏生物标志物的应用

　　心血管疾病（CVD）是严重威胁人类健康的疾病，CVD的早期诊断和危险分层将有助于准确及时地对这些患者进行诊断和治疗。目前由于更多的心脏生物标志物（BM）的发现和研究为CVD的诊断、预后方面提供了新的认识，现做一简要的综述。
　　1 、        心脏损伤标志物
　　（1）  心肌酶谱和肌钙蛋白
　　以往的心肌酶限于急性心肌梗死（AMI）的诊断，自心肌肌钙蛋白（cTns）应用于临床后在心肌坏死的诊断、CVD的危险分层、预后判断等方面有了更深的认识。在2000年，美国将检测定义AMI的标志物包括为心肌坏死的特异性标志物：cTns（cTnI，cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB），而不使用肌酸激酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶等旧的非特异性心脏标志物[1]。由于cTns升高即诊断AMI，使得AMI的诊断阈值降低，临床中大大增加了AMI患者的数量。
　　肌红蛋白是存在于心肌、骨骼肌的亚铁血红素蛋白，是最早的心肌损伤标志物，在心肌损伤1～2 h后即可检测到，但无心脏特异性。在肾衰、骨骼肌损伤、创伤和其他疾病中亦升高。由于灵敏度高，检测阴性可用于早期排除AMI。
　　CK-MB在心肌损伤4～6 h后快速释放，比肌红蛋白更具心脏特异性，但也包含了5％的骨骼肌成分，因此在非心脏疾病情况中亦增高。在使用cTns前CK-MB是诊断AMI的“金标准”，在确定心肌梗死（MI）范围和再梗死方面具有重要作用。
　　cTns是目前诊断心肌损伤和心肌坏死时特异度最强、敏感度较高的生物标志物，在急性冠脉综合征（ACS）危险分层也有重要的临床应用价值。cTns在心肌损伤后4～12 h升高且保持升高4～10 d。cTns随不可逆的缺血心肌细胞损伤后进入血流，较长时间保持升高。由于cTns具有诊断时间“窗口”长的优点，亦可作为ST段抬高心肌梗死(STEMI)较晚期的诊断指标，且敏感性高，可诊断微小MI。cTnI由于独特的氨基酸序列而具有较高的心肌特异性，迄今为止是心肌唯一特异的心肌蛋白，还没有证据表明人和动物的再生或病变骨骼肌表达cTnI或可检测cTnI的mRNA，cTnI可敏感地测出小灶性可逆性心肌损伤存在。cTnT亦仅存于心肌细胞中，用单克隆抗体测定cTnT时，与骨骼肌TnT的交叉反应阳性率＜5％，但在部分肾功衰竭（肾衰）透析患者血中cTnT升高，多发性肌炎、进行性肌营养不良等情况横纹肌有cTnT亚型的存在。
　　cTns可检测出1 g的心肌组织坏死，甚至cTns 微小的升高亦与心肌坏死和近、远期的死亡率升高有关[2]。早在1997年Vecchia等[3]报道了无临床AMI的进展性心力衰竭（心衰）患者cTns水平升高。Missov等[4]后来也报道在心衰患者中cTnT升高，其水平与心衰的严重程度相平行。他们认为cTnT升高与心肌细胞游离池中的具有免疫活性的cTnT的漏出有关，甚至在25％ ～33％严重急性失代偿心衰患者中可检测出cTnT。大多研究者认为cTnT的升高反映了终末心衰患者存在进行性心肌坏死，表明预后更差。Sato等[5]研究了60例扩张型心肌病患者，通过常规治疗仍有17例cTnT浓度持续升高，这些患者心脏更大、左室射血分数（LVEF）更低、生存率更低。Horwich等[6]研究了238例排除心肌炎、AMI的严重心衰患者，通过最新的高敏感性cTnI检测方法，发现117例（49.1％）cTnI升高，其血流动力学更差、LVEF更低。总之，进展性的严重心衰患者cTns可能升高，尽管机制不明确，但与预后相关，多数研究者认为与低水平的心肌坏死有关。
　　此外，在肾衰中无ACS的患者亦出现cTns的升高，cTns水平从基线急性升高与死亡率的增加有关[7,8]。肾功能不全患者cTns升高可能与肾脏清除率下降有关，目前机制不明确。还有假设认为在肾衰中cTns升高来源于骨骼肌，但证据不足。微小的MI亦可解释这种升高现象，已有病理学证据证实在肾衰患者中存在微小的MI。由于约6 ％ ～8 ％ cTnT、3 ％ ～5 ％ cTnI以游离形式存在于胞浆中，在急性心肌损伤时游离的cTns能更早地释放入血，所以会出现轻度的升高。cTnT由于分子量较大，在胞浆中游离存在形式高于cTnI，因而比cTnI升高更常见。
　　由于这些BM的上述释放、清除动力学特点，目前推荐多个标志物的结合使用，这样可使AMI诊断敏感性接近100 ％ 。心肌缺血、不稳定型心绞痛（UA）不能通过CK-MB、cTns等心肌坏死标志物确定，而诊断AMI需结合ACS的临床证据[1]。
　　（2）   缺血修饰白蛋白
　　缺血修饰白蛋白（IMA）是一种新的缺血标志物，是美国FDA批准的第一个用于检测心肌缺血的心脏标志物。IMA是由于缺血过程中低的pH环境诱发N-末端白蛋白构型改变而产生，表现为血清蛋白与外源性钴离子（CO2＋）结合能力减弱。主要机制包括内皮及细胞外缺氧、酸中毒、自由基损伤，细胞膜能量依赖的Na+-K+泵破坏和游离CO2＋增多。IMA不仅可检测出心肌缺血，而且在心肌缺血发作后迅速升高，在可疑ACS而无心电图变化的患者中，IMA识别已明确的UA的敏感性较高，但特异性不高。IMA在缺血发作5～10 min浓度即可升高，其灵敏度显著高于cTns，但阳性预测值低，其临床特异度还需临床研究证实。目前研究表明IMA结合cTns有助于提高ACS诊断的特异性。Bhagavan等[9]报道IMA结合cTns诊断心肌缺血的敏感性、特异性分别为88 ％、94 ％，阳性和阴性预测值分别为92 ％ 和91 ％，但IMA区别心肌缺血患者是否存在MI能力较差。IMA还可作为经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）一过性缺血的早期敏感指标，PTCA后数分钟即可升高，6 h回到基线，并可评价PTCA有关的冠状动脉的侧支循环情况[10] 。
　　IMA对于ACS预后具有一定的评价意义，ACS患者IMA水平明显高于稳定性冠心病（CHD）和正常者，Aparci等[11]通过ROC曲线分析确定IMA剪切值（cutoff value）为477 U/ml。IMA＞477 U/ml者死亡率明显增高，以此值预测1年死亡率的敏感性、特异性分别为70 ％ 和82 ％。
　　IMA升高还可见于肿瘤、感染、终末期肾病、肝病、脑缺血患者。尽管IMA可能成为一种快速检测ACS的标志物，但仍需进一步研究。
　　2、         心血管炎症及相关标志物
　　动脉粥样硬化（AS）是一种炎症性疾病，粥样斑块的发展和破裂导致ACS的全过程被认为是对损伤的炎性反应。流行病学证实，ACS患者血清中与炎症有关的生物标志物如C反应蛋白（CRP）、金属基质蛋白酶（MMPs）、白介素-6（IL-6）等升高，已被用于未来心血管事件发生的预测指标。
　　（1）  C反应蛋白
　　粥样斑块内局部的炎症反应产生的细胞因子和炎性介质可以促进肝脏合成急性期反应物，包括CRP、纤维蛋白原、血清淀粉样A蛋白等，研究已证实与心血管危险性增加有关。CRP具有激活补体，促进吞噬细胞的活性，刺激单核细胞表面的组织因子表达和其它免疫调控功能，具有调理素作用，它在组织损伤，炎症反应的病理生理中有重要意义。炎症细胞具有CRP受体，CRP通过其受体活化细胞，通过直接浸润或产生细胞因子作用而损伤血管。
　　由于健康人体的CRP水平通常＜3 mg/L，因此使用高敏感的检测方法[高敏C反应蛋白（hs-CRP）]用于CVD的筛查。对于CVD的危险性评估时，hs-CRP＜1.0 mg/L为低危，1.0～3.0 mg/L为中危，＞3.0 mg/L为高危。如果hs-CRP＞10 mg/L表明存在其他炎症,需进一步复查。hs-CRP被认为是心血管危险性最强烈的预测因子，但广泛应用于临床必须解决检测方法和参考值标准化问题[12]，而且当前在临床实践中其诊断、预后或治疗学等方面的作用还需进一步证实。
　　近期待发表的MONICA/KORA Augsburg 队列研究通过对3 620名中年男性检测hs-CRP预测全因死亡、致死的CVD、CHD等方面表明，hs-CRP＞3.0 mg/L者为 hs-CRP＜1.0 mg/L者的2倍，危险比（HR）分别为1.88、2.15和1.74。来自同一队列的另一研究通过对2 000多例中年健康者进行平均11年的随访发现，在CHD发病群体中CRP和IL-6水平较未发病者明显增高，而IL-18水平在两组间未见明显差异，提示该群体CRP和IL-6浓度的增加是未来CHD事件的独立预测因素[13]。但是hs-CRP浓度增高的程度对CVD的预测仍需进一步的研究，研究群体的炎症状态会影响其与CVD事件的关系。过高的hs-CRP浓度（＞10 mg/L）往往与炎症状态有关，而即使在健康者群体中也有较高的炎症状态发生率，较高的CRP浓度与CVD事件并不成线性关系，对CVD风险的评价需慎重[14]。
　　（2）  金属基质蛋白酶
　　斑块破裂之所以与炎症有关，是因为炎症细胞是斑块稳定性的重要调节者。炎症细胞可产生MMPs、白介素（IL）、肿瘤坏死因子等物质，这些物质相互作用可降解细胞外基质。内源性抑制因子称为金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs），连接于MMPS的活性部位调节其活性。单核/巨噬细胞可分泌以酶原状态存在的MMPs，血管平滑肌细胞、T淋巴细胞、内皮细胞分泌的细胞因子如IL-1、肿瘤坏死因子-α等具有刺激MMPs基因表达作用，MMPs能特异地与细胞外基质各成分结合并降解胞外基质，使斑块纤维帽削弱，同时抑制血管平滑肌细胞增生而促进其凋亡，当斑块脂质核心增大、纤维帽进一步变薄受损时，斑块破裂及继发血栓形成而导致ACS。Blankenberg等[15]对1 127例确诊冠心病的患者进行4年余的研究发现血清MMPs水平与患者致命性冠状动脉疾病的发生风险密切相关，其独立于其它传统的CVD危险因素。
　　AMI和UA患者的MMP-1、MMP-2和MMP-9是显著增高的。AS发生时，局部缺血缺氧，氧化的低密度脂蛋白（ox-LDL）可诱导斑块内表面及斑块内新生血管壁上的内皮细胞分泌MMP-1、MMP-2和MMP-9。其中MMP-2和MMP-9是降解细胞外基质的主要成分，在易于破裂的斑块肩部，胶原分解的增强与巨噬细胞产生的MMPs密切相关。Naruko等[16]研究显示MMP-9与未来心血管病死亡具有相关性，在校正了CRP、纤维蛋白原、IL-6和IL-18等其它炎性因子影响后，对于心血管病预后具有意义。Robertson等[17]通过使用带远端保护装置的经皮冠状动脉介入治疗术检测ACS患者血浆MMP-9浓度，在冠脉的“罪犯”病变血管处局部MMP-9、IL-6、ox-LDL浓度增加，从而证实其为不稳定斑块的“识别”标志物，其血浆中浓度的增加可能来源于不稳定斑块的释放。
　　MMP-9在AMI后还有助于评价左室重塑，Squire等[18]报道了ST段抬高MI后心室功能的改变与MMP-9和TIMP-1的浓度关系。MMP-9在第1天和第4天产生了双相的峰值。相反，TIMP-1从AMI后第1天至第5天开始降低。MMP-9浓度越高，提示左室越大，脑钠肽（BNP）浓度越高。
　　（3）  细胞黏附分子
　　正常的血管内皮可抵抗循环中白细胞的黏附，早期粥样斑块的形成涉及内皮功能不全和白细胞聚集。正常情况下介导血管内皮细胞与白细胞相互作用的黏附分子[如血管细胞黏附分子(VCAM-1)、细胞间黏附分子（ICAM-1）、P-选择素、E-选择素等]不表达或低表达；在炎症反应中，被激活的白细胞黏附到血管内皮，能通过一系列机制促进内皮细胞损伤、血管内皮功能障碍，使ICAM-1等表达增加，血液中巨噬细胞、T淋巴细胞广泛的通过内皮浸润到内膜。研究显示，黏附分子介导的细胞之间、细胞与细胞外基质之间的黏附作用可能是导致局部炎症反应和血栓形成的重要因素。VCAM-1对单核细胞和T淋巴细胞有特异性亲和力，低密度脂蛋白（LDL）通过氧化、糖化、聚集、免疫复合物形成等途径修饰成为ox-LDL，经巨噬细胞吞噬后聚集于血管内膜形成脂质斑块，并可能通过引发炎症而使VCAM表达增加，使局部炎症细胞反应增加[19]。PRIME研究[20]对9 758例健康男性随访10年发现，心绞痛、CHD死亡、AMI等事件的发生与ICAM-1和CRP的升高有明显相关性。Guray等[21]研究发现VCAM-1在ACS中表达明显增加，更能预测斑块的稳定性。
　　其它的涉及细胞黏附分子包括P-选择素、E-选择素等亦显示出与心血管危险预测具有相关性。
　　（4）  髓过氧化物酶
　　髓过氧化物酶（MPO）是一种在LDL氧化过程中的炎症前活化酶，是粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒的血红素蛋白酶。MPO是中性粒细胞、单核细胞和某些巨噬细胞中含量最多的蛋白质。冠脉粥样斑块中大量单核细胞浸润、活化并脱颗粒，同时释放大量MPO，造成冠脉粥样斑块病变处和循环中MPO水平增高。Zhang等[22]研究显示在冠状动脉疾病（CAD）患者血和白细胞中MPO活性增高，而且其活性与CAD程度具有明显的相关性（OR 11.9），独立于年龄、性别、吸烟、糖尿病、LDL浓度、白细胞计数等危险因素。研究显示MPO在LDL氧化过程中扮演了重要角色，MPO作为一种心血管危险的预测和可疑ACS的诊断具有一定前景。黎莉等[23]研究发现，在ACS患者中冠脉循环和体循环中MPO浓度存在梯度，提示中性粒细胞随血液流经冠脉病变处血管床时，将细胞内活性物质分泌出来，参与了病变局部的炎症反应，消耗了MPO，致使经过冠脉循环血液的MPO含量降低，从而提示MPO是反应AS斑块局部炎症的较好指标。
　　MPO对于ACS预后具有一定的预测价值。Cavusoglu等[24]发现基线MPO水平对ACS患者长期预后有意义。通过对193例ACS患者随访2年发现，以患者入选时MPO水平的中位数为预测剪切值（20.34 ng/ml）,无MI事件者88 ％ ≤20.34 ng/ml，而发生MI事件者74％＞20.34 ng/ml（P=0.024 9）,研究者认为基线MPO水平是ACS患者2年MI事件的独立预测因子。Mocatta等[25]研究发现，MPO水平在AMI患者入院24 h至96 h高于对照组（55 ng/ml vs 39 ng/ml，P＜0.001）。MPO浓度高于中位数水平是死亡的独立预测因子（OR 1.8, P=0.034），如果合并高的N末端脑钠肽前体（N-pro-BNP）浓度和低的LVEF值则死亡率更高。
　　但是，尽管MPO参与了CAD炎性过程，由于中性粒细胞活性并非缺血诱导，因此MPO最多只是斑块不稳定的标志物，而不是氧化应激或损伤标志物，并且不可能具备心脏特异性。
　　其它与心血管危险增加相关的炎症前酶是脂蛋白相关磷脂酶A2和孕相关血浆蛋白-A。
　　3、        心脏功能标志物
　　利钠肽是一类具有扩张血管、拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统，抑制交感活性，促进尿钠排泄、减少水钠潴留等作用的心血管肽类激素。BNP是利钠肽家族成员之一，自1988年发现至今，在CVD诊治方面的应用越来越广泛。近年来BNP作为一种有价值的临床生化标志物，可以为CVD患者提供诊断、预后判断及治疗疗效评价，并引起广泛关注和重视。BNP和N-pro-BNP最适合可疑心衰患者的诊断。Maisel[26]等进行的多中心试验显示：BNP浓度与心衰患者NYHA等级具有高度相关性，而且BNP与血流动力学指标如左室舒张末压（LVEDP）、肺契压（PCWP）有关。在失代偿心衰患者最高，已有左室功能障碍而无急性发作者中度升高，而无心衰或左心功能不全者最低。以100 μg/L为界值诊断心衰的敏感性为90 ％，特异性为76％，具有83％的准确性；而以50μg/L为界值具有更好的排除作用，其阴性预测值为96 ％。
　　由于BNP是一种神经激素且半衰期较短（18～22 min），亦可通过监测其浓度进行疗效判定及预后评价。以监测BNP浓度为指导的心衰治疗较传统的经验治疗相比可明显减少心血管事件的发生。Tsutamoto等[27]认为NYHA心功能分级、PCWP、LVEF、BNP、心房肽（ANP）等均是慢性充血性心衰患者死亡的独立危险因素，Kaplan-Meier生存分析显示，BNP浓度每增加10 pg/ml，2年随访期内心脏性死亡率增加3 ％。Berger等[28]对452名LVEF≤35％的慢性充血性心衰患者随访3年发现与ANP、内皮素相比，BNP是猝死（SD）的独立预测因素，BNP<130 pg/ml组SD为1 ％；而BNP>130 pg/ml组SD为19 ％（P=0.0001）。
　　近期的研究[29，30]表明，N-pro-BNP与BNP血浆浓度高度相关，且由于其半衰期长（60～120 min），因而认为在心衰诊断中应用价值可能优于BNP。两者均随NYHA心功能降低而升高，且N-pro-BNP升高更明显，以LVEF≤40 ％ 为标准时，两者的ROC曲线下面积无差异；以LVEF≤50 ％为标准时，N-pro-BNP的ROC曲线下面积高于BNP（0.82 vs 0.79），因而认为N-pro-BNP更适用于轻中度心衰的诊断。Tsutamoto等[30]通过测量353名慢性心衰患者主动脉和冠状静脉窦内BNP和N-pro-BNP浓度发现，两者浓度梯度经心脏增加，N-pro-BNP更明显，在心衰患者预后评价方面N-pro-BNP亦优于 BNP。
　　近来的研究还表明，BNP和N-pro-BNP亦可用于心功能和病情稳定的CHD患者预后分析。
　　4、        总结
　　目前，越来越多的心脏生物标志物的应用为临床诊断提供了新的方法和思路，其与CVD的病理生理学的密切联系使其成为倍受关注的诊断和预后的工具。但是一些标志物由于缺乏特异性，在临床研究中仍然存在争议，仍没有充分的证据明确一些标志物是CVD的参与者还是“旁观者”，其血清或组织中水平的升高是始动因素还是继发因素。但不管怎样，各生物标志物的出现贯穿、演变于CVD的不同阶段，已成为CVD的“标志”。具有高度敏感性、特异性的心脏生物标志物的研究已经成为临床研究的热点，对于疾病的诊断、预后判断已经显示出一定的价值。今后还需要进一步的研究证实或检验一些生物标志物的临床意义。