1.增菌：
A、碎牛肉
稱取25g樣品,置於勻質杯中,加入100mL增菌肉湯.用勻質器以8000-10000r/min勻質30s。將勻質液通過滅菌紗布,倒入250mL三角瓶中,於微氧條件下,37℃預增菌4h後,42℃培養20-44h。
B、淨膛全禽和分割肉
在一個滅菌容器中,用250mL滅菌營養肉湯振搖洗滌樣品5min.肉湯經滅菌紗布過濾,於23000xg、4℃離心20min,或於16300xg、4℃離心30min,棄去上清液,將沉澱物置於250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉湯,搖勻。 於微氧條件下,37℃預增菌4h後,42℃培養20-44h。
C、牛奶
稱取40g牛奶放入離心管中,按2.條中方法離心.棄去脂肪和上清液將沉澱物置於250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉湯,搖勻。於微需氧條件下,35℃預增菌4h後,42℃培養20-44h。
D、貝類
將100g樣品和100mL增菌肉湯放入均質杯中,用均質器以8000-10000r/min均質30s。用滅菌紗布過濾,取濾液50mL濾液放入500mL三角瓶中,加入200mL增菌肉湯, 於微氧條件下,37℃預增菌4h後,42℃培養20-44h。
E、河水或汙水
取水樣2-4升,每升水樣加入5mL1M硫代硫酸鈉,用0.45μm微孔濾膜過濾,立即將濾膜置
於100mL增菌肉湯中, 於微氧條件下,30℃預增菌3h後,再於37℃增菌2h,然後於42℃培養20-44h。
2.分離和初步鑑定
取5mL經20-44h增菌的培養物,以0.65μm孔徑濾膜過濾.取經過濾和未經過濾的增菌培養物,分別在分離用瓊脂平板上劃線接種,各不少於二個平板.將平皿置於微需氧條件下42℃培養24-48h。檢查平板上有無透明-白色-棕黃色(可能出現淺紅色)凸起、邊緣不整齊、有時沿接種線向外擴散的菌落.挑取典型菌落製作溼片,用相差(或暗視野)顯微鏡檢查,本菌呈快速螺旋運動。塗片作革蘭氏染色鏡檢時,本菌為革蘭氏陰性,如小逗點狀,兩菌體的末端相連時,呈S形、海鷗形或螺旋狀.挑取初步鑑定為彎曲桿菌的菌落,在布氏瓊脂上劃線作純分離。培養方法同上。根據生化、生長特性和抗生素敏感性試驗進行菌株證實。
3.證實試驗
從用作純分離的平板挑選二個典型菌落。從每個典型菌落各挑取一滿接種環,分別接種於50mL三角瓶中的4mL布氏肉湯中,於微需氧條件下42℃培養24 -48h.同時接種一份陽性培養物作為對照。通常用於生長試驗和生化反應的基礎培養物是含0.18%瓊脂的布氏肉湯。該培養基分裝於試管中,每管7mL。從所有布氏肉湯中取出接種物,滴加0.2-0.3mL於瓊脂表面。
(1).生長溫度試驗
接種3管含0.002%中性紅(NR)的基礎培養基,其中一管置於37℃培養,檢查在這一溫度下的生長情況,並用於觀察過氧化氫酶反應。另二管分別置於 25和42℃培養。每日檢查有無生長。對未生長者,需培養5d方可作出最後判斷。彎曲桿菌的生長僅限於接近培養基表面的一薄層,廣泛的生長不是彎曲桿菌屬細菌所致。
(2).過氧化氫酶試驗
滴加3%過氧化氫溶液於有細菌生長的試管中,產生氣泡者為陽性反應。
(3).氧化酶試驗
使用瓊脂平板表面經24h培養的生長物.將氧化酶試劑滴於棉拭子上,用棉拭子接觸生長物表面,接觸點變為深藍色者為陽性。
(4).硝酸鹽還原試驗
將供試培養物接種於含1%硝酸鉀的基礎培養基中,置空氣中於37℃培養5d.加入亞硝酸鹽檢測試劑,出現紅色者為陽性反應。
(5).1%甘氨酸中生長試驗
將供試培養物接種於加有NR和1%甘氨酸的基礎培養基。置空氣中於37℃培養.每日檢查有無生長,對未生長者需培養5d,方可作出最後判斷。
(6).3.5%氯化鈉中生長試驗
將供試培養物接種於加有NR和3.5%氯化鈉的基礎培養基。置空氣中於37℃培養.每日檢查有無生長,對未生長者需培養5d,方可作出最後判斷。
(7).硫化氫產生試驗
將肉湯培養物接種於加有0.02%鹽酸半胱氨酸的基礎培養基,將一根浸有飽和乙酸鉛的濾紙條懸於試管的上部(不讓濾紙條接觸培養基),旋緊試管帽。 置空氣中於37℃培養.每日檢查，觀察濾紙條是否變黑，變黑表明有硫化氫產生，為陽性反應。對未出現陽性反應者需培養5d,方可作出最後判斷。
(8).TSI試驗
接種於TSI斜面，於微需氧條件35-37℃培養5d.空腸彎曲菌不產生硫化氫。所有彎曲桿菌屬為鹼性/鹼性反應。
(9).麥康凱試驗
將供試培養物接種於麥康凱培養基,於微需氧條件37℃培養3d,記錄有無生長。
(10).馬尿酸鹽水解試驗
用試管分裝馬尿酸鹽水解培養基,每管0.4mL,凍存備用。將瓊脂平板上培養過夜的生長物接種於1%馬尿酸溶液中,振搖後置37℃水浴中放置2h。每管加入0.5mL茚三酮試劑(將3.5g茚三酮溶於100mL1:1丙酮和丁醇中),室溫下放置2h,出現紫色者為陽性反應。
(11).抗生素敏感性試驗
用滅菌棉拭子將預先準備好的布氏肉湯培養物塗布於布氏瓊脂平板。將頭孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圓紙片分別貼於平板表面。於微需氧條件37℃培養24h,檢查有無抑菌圈。
根據生化鑑定結果表對細菌作出鑑定。
