碱性成纤维细胞生长因子对人类晶状体上皮的影响

　　目的：为研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及其受体抗体对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells, HLECs)超微结构的影响。
　　方法：采用透射电镜观察正常HLECs及bFGF作用后及受体抗体阻断bFGF在HLECs作用的超微结构变化。
　　结果：正常HLECs胞内较多的线粒体、粗面内质网和游离核糖体及少量微丝结构，核膜完整，染色质均匀。bFGF作用后表现为细胞膜完整，膜局部突起较多，线粒体和游离核糖体明显增多，基质较致密，细胞核附近有较多微丝结构，核膜完整，染色质均匀，核仁增大。bFGF受体抗体阻断作用后表现为细胞突起消失、细胞膜明显破坏，大量线粒体空化，嵴消失，基质减少，呈云雾状退化，内质网明显减少至消失，核膜破坏明显，有的细胞结构不清，趋于死亡。
　　结论：bFGF对HLECs的促增殖作用可被FGF受体抗体所阻断。
　　后囊混浊的发生与术后晶状体上皮细胞增殖、迁移及纤维化有关，在晶状体后囊变化与生长因子的作用密切相关，尤其是碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)受体的作用更不容忽视。阻断FGF受体可抑制bFGF对HLECs增殖作用[1]，我们对其作用使细胞超微结构发生变化进行研究。
　　1、材料和方法
　　1.1、胎儿晶状体上皮细胞培养  同一个胎儿新鲜的2个眼球，生理盐水充分冲洗干净，再用庆大霉素冲洗，置干净的玻璃器中，清除眼球周围组织，剪去结膜。用已稀释的庆大霉素溶液充分冲洗已处理的眼球，置另一干净的玻璃培养器中，在超净工作台上距角膜缘约4cm处环形剪开巩膜，移去上部（角膜用作培养角膜上皮细胞）后取出晶状体。沿晶状体赤道部分离出前囊膜，放入27mm直径的塑料培养皿，细胞面朝皿底，加几滴合150g/L DMEM培养液（pH 7．2），用虹膜剪子将囊膜尽量剪成碎块，展平并分散开后放入CO2箱（日本SANTO公司MCO17AI）中约4h，然后，轻轻地补加培养液约2.5mL，继续培养（培养条件为37℃，50mL/L CO2，饱和温度。每日显微镜下观察细胞生长情况，7～10d更换培养液。
　　传代培养：当细胞生长融合时，吸出培养液，用Hanks液冲洗2次，加2.5g/L胰蛋白酶溶液1.5mL，消化4～8min吸出，加入含150g/L FCF DMEM培养液反复吹打，使细胞悬浮，公布均匀，然后分至几个培养皿继续培养。
　　1.2、细胞标本的制备  使用2代细胞进行实验。将切成小块的盖玻片消毒后放在27mm直径的玻璃培养器内，将胎儿晶状体上皮细胞、加入bFGF（100μg/L）细胞及加入bFGF（100μg/L）和bFGF受体抗体（5mg/L）的细胞悬液分别滴在培养器内的盖玻片小块上，制成3个不同样本，放入CO2培养箱内4d。
　　1.3、透射电镜标本制作  待盖玻片长满细胞，弃去培养液，用Hanks液冲洗2次。用橡皮刮刀将贴壁生长的细胞刮下，离心后去除上清，30g/L戌二醛固定后，加入10g/L锇酸固定，乙醇逐级脱水，Epon812渗透包埋，60℃温箱内聚合72h，LKBB400型超薄切片机切片，醋酸铀和枸酸铅双染，于philips EM 400T透射电镜下观察并照像。
　　2、结果
　　2.1、胎儿晶状体上皮细胞  胎儿晶状体上皮细胞（2代）表现胞内正常的线粒体、粗面内质网、游离核糖体及少许微丝结构；核膜完整，染色质均匀，细胞器数目有限，提示了HLECs功能尚可，但其有增殖能力差的特点。
　　2.2、加入bFGF（100μg/L）的胎儿晶状体上皮细胞  在胎儿晶状体上皮细胞培养中加入bFGF，其细胞超微结构为：细胞膜完整，局部突起较多，呈短棒或指状；胞内较丰富的细胞器，尤其可见功能良好的线粒体明显增多，基质亦较致密，并见游离核糖体增多，近核附近有较多沿细胞长轴平行排列的微丝结构；核膜完整，染色质粗大、均匀，核仁增大。细胞器增多，说明了加入bFGF后，其对细胞发挥了促增殖作用，使细胞的代谢功能旺盛，有丝分裂能力增强；同时说明了bFGF对此细胞亦有一定的分化效应，如超微结构见到沿长轴排列的微丝结构，是细胞分化后典型的特征。
　　2.3、加入bFGF（100μg/L）和FGF受体抗体（5mg/L）胎儿晶状体上皮细胞  同时加入bFGF和FGF受体抗体时，细胞超微结构表现为细胞突起消失，膜明显破坏，大量线粒体空化，嵴消失，基质减少，呈云雾状退化，内质网亦明显减少甚至消失，仅有少量微丝并呈断裂状，细胞器明显减少、破坏，有的消失；核膜破坏明显；有的细胞结构不清甚至趋于死亡，提示了抗体中和实验bFGF受体被其抗体所拮抗，使bFGF的作用消失，细胞代谢基本消失，并趋向死亡状态。
　　3、讨论
　　晶状体上皮细胞是晶状体中唯一含有较多丰富细胞器的一种细胞，其环境也与其它的上皮细胞不同，它对维持晶状体代谢起着重要作用。前囊中央的上皮细胞相对静止，赤道部的上皮细胞却在人的一生中不断增殖且向晶状体的前后极延伸、逐渐分化成晶状体纤维细胞并形成晶状体的多层结构，而在此过程中细胞体拉长，细胞器减少等变化。
　　文献报导，对晶状体的电镜观察，发现前囊与赤道部的囊膜与晶状体细胞紧密连接，后囊较薄，无细胞结构。晶状体上皮细胞由于有大量微绒毛存在而扩大了细胞的表面积，为该部细胞与房水之间的物质交换提供了场所，因而也加快了晶状体纤维与房水之间物质交换过程。线粒体在机能状态良好的细胞中呈杆状或卵圆状，数量较多，当机能低下或代谢不良时能变成颗粒状或集聚成更大的团粒；微管和微丝构成了细胞质骨架，它们除与支持细胞形态和与细胞运动有关外，对细胞膜的运动如吞饮、免疫反应等都有影响。
　　一般来说，已经纤维化的拉长细胞对bFGF的反应能力是不同的，细胞拉长也表明了是与早期纤维分化活动相一致的。后囊下发生白内障时，周围晶状体上皮细胞向后方移行而形成多层的斑状、肿胀细胞和一些拉长的细胞，这时，丰富的囊膜样基质积累于囊膜下面和细胞之间，还有重要的粗面内质网、高尔基复合体、微丝以及明显的囊膜皱褶和凋亡细胞的变化；这与白内障术后后囊混浊的相似变化有一定的联系。而最近对前囊混浊的研究，也得出相似结果。
　　本实验通过透射电镜观察发现，加入bFGF后，细胞器增多，说明了其对细胞发挥了促增殖作用，使细胞的代谢功能旺盛，有丝分裂能力增强，同时说明了bFGF对此细胞亦有一定的分化效应，如超微结构见到沿长轴排列的微丝结构，是细胞分化后典型的特征。在相同条件下，加入bFGF同时加入FGF受体抗体时，细胞器明显减少、破坏，有的消失，核膜破坏明显，有的细胞结构不清甚至趋于死亡，提示了抗体中和实验bFGF受体被其抗体所拮抗，使bFGF的作用消失，细胞代谢基本消失，并趋向死亡状态。成纤维细胞生长因子受体由细胞外配体区、螺旋状跨膜区和胞内区组成，四种FGF受体基因可产生48种受体异构体。FGFR1在晶状体上皮细胞中表达随年龄的增加而减少，但FGF作用后FGFR1的表达增强，在细胞发育和纤维化中起重要作用。无论以何种方式阻断FGF受体，都可抑制晶状体细胞的增殖。电镜观察发现，实验证明，bFGF在维持囊膜对晶状体上皮细胞的支持方面起重要作用。bFGF对晶状体细胞的促增殖作用是其与FGF受体结合后通过MAPK/ERK信号系统而起作用的。bFGF与其受体在晶状体上皮细胞增殖、分化方面起重要作用。我们的结果从超微结构证实了bFGF对HLECs的促增殖作用及这种作用可以被其受体的抗体所阻断的效应；同时亦从微观上间接的提示bFGF发挥其生物学效应是通过与细胞表面的受体结合而实现的。为体内实验从分子水平上阐述bFGF作用及“受体结合”学说提供了依据。