乾眼症的體內共聚焦顯微鏡檢查

　　【摘要】乾眼症是最常見的眼部疾患之一。儘管在過去的幾年中，與其相關的基礎與臨床研究獲得了不少進展，但其病理生理機制仍不十分明晰。活體共焦顯微鏡是一種非侵入性的眼部成像技術，它使得人們在細胞水平對眼表上皮細胞、免疫及炎症細胞、角膜神經、角膜基質細胞、以及瞼板腺結構進行觀察成為可能。因此，它可以幫助人們更好地理解乾眼症的發病機制以及病理生理，從而協助該病的診斷和治療。使用共焦顯微鏡可對乾眼相關情況下的眼表結構作出評估，並對其改變進行量化，這樣使得疾病在早期就能得到識別，並利於對患者的分層治療。此外，動態地觀察眼表共焦圖像的變化還可以對乾眼症的臨床治療效果進行監測，利於及時調整治療方案，並較為準確地評估預後。
　　【關鍵詞】乾眼症；活體共焦顯微鏡；眼表；瞼板腺
　　根據2007年國際乾眼研討會的定義，乾眼症（dry eye syndrome, DES）是一種“導致不適症狀、視覺障礙、淚膜不穩定伴潛在眼表損害的淚液和眼表的多因素疾病；它還伴有淚膜滲透壓的升高和眼表炎症”[1]。由於缺乏統一的診斷試驗及標準，乾眼症的確切患病率尚未可知；但據估計，50歲以上的人群當中，乾眼症的患病率約為5％-30％，且隨著人口老齡化的進展，其必將繼續增長[2]。此外，乾眼症的病理生理機制仍需深入研究，且自2002年以來美國所有關於乾眼症新療法的臨床試驗均以失敗告終，上述情況均給眼科醫師們出了難題。
　　角膜活體共焦顯微鏡（in vivo confocal microscopy, IVCM）是一種具有高分辨率的新型非侵入性的眼表成像儀器。其獨特的物理性質使人們對活體角膜各層進行細胞水平的觀察成為可能，從而被日益廣泛地用於多種角膜疾病的研究，如上皮病變、各種基質變性及營養不良疾病、內皮病變、角膜沉積物、感染和外傷病灶等[3]。使用IVCM對乾眼症患者的角膜上皮、角膜基質細胞、角膜神經及角膜內的免疫和炎症細胞等進行觀察，不但可以進一步闡明乾眼症的病理生理機制，還能夠監測患者的病情變化從而評價治療效果。
　　本文將對應用IVCM在乾眼症患者中所觀察到的角膜、結膜、瞼板腺等結構的細胞水平變化作一總結陳述，以期對未來的相關研究有所啟發。
　　一、角膜
　　乾眼症患者眼表的炎性細胞因子和蛋白水解酶的產生增加/清除減少，從而對角膜各層細胞及神經等結構產生影響；而且已有研究證實幹眼症患者的角膜厚度普遍明顯變薄[4]。
　　（一）角膜上皮
　　在正常情況下，角膜上皮作為抵禦病原體及其它有害物質的重要屏障，在眼表穩態中扮演重要角色；但在乾眼症患者當中，角膜上皮的微結構改變明顯。通過IVCM觀察可見乾燥綜合徵（sjogren's
　　syndrome, SS）性乾眼患者的角膜表面上皮細胞形態不規則並伴有斑片狀改變[5]；且Chen等人[6]發現乾眼症患者表面角膜上皮不透明細胞的平均面積明顯增大（P<0.0001< span="">），不透明細胞的面積與臨床乾眼指標，如視物模糊的症狀（r=0.86,
　　P=0.0001）、結膜麗絲胺綠染色評分（r=0.4,
　　P=0.026）、角膜熒光素染色評分（r=0.5,
　　P=0.002）等存在明顯相關性。此外，某些乾眼症患者角膜上皮熒光素染色陽性，該體徵經由IVCM觀察證實是由於表面角膜上皮細胞異常，如緊密連接完整性受損、上皮通透性增加、以及細胞死亡等，其攝取熒光素增加所造成的，而非既往所認為的角膜上皮缺損處著染[7]。使用IVCM對角膜上皮進行定量觀察發現，乾眼症患者角膜上皮各層細胞密度可能發生變化[8-11]：普遍認為患眼表面及中間上皮細胞密度顯著減小，但基底上皮層細胞的密度變化則存在爭議，不同研究顯示其密度可能增大或減小，也可能無明顯變化。
　　（二）角膜基質
　　某些角膜的IVCM觀察研究發現，除了角膜上皮的微結構改變，乾眼症患者的角膜基質細胞也會發生形態及數量方面的變化。Tuominen等人[5]發現，SS患者角膜基質層變薄，且其角膜基質細胞存在異常高反光；後續研究相繼顯示，與健康對照組相比，甲亢眼病相關性乾眼[12]以及類風溼關節炎伴SS患者[13]角膜基質中的異常高反光細胞明顯增多；雖然不少研究者認為這些高反光細胞是呈“激活狀態”的角膜基質細胞[14]，但這些細胞是否可能為骨髓間質來源的細胞還有待證實。此外，Benítez del Castillo等人[8]的研究提示SS相關性乾眼患者角膜前基質層的細胞密度（1348±220/mm2）明顯高於非SS相關性乾眼患者（1183±273/mm2）以及N＜60歲（1107±210/mm2）和N≥60歲組（1075±201/mm2）；但就後基質層細胞密度而言，SS相關性乾眼患者（808±117/mm2）、非SS相關性乾眼患者（795±150/mm2）、N＜60歲（741±142/mm2）和N≥60歲（768±119/mm2）各組間則不存在統計學顯著性差異。類似地，Villani等人[13]的研究則提示類風溼關節炎伴或不伴SS組的角膜前、後基質層細胞密度均明顯高於健康對照組患者（P＜0.001）。
　  （三）角膜神經
　　由於角膜神經在調節角膜感覺、上皮完整性、細胞增生、傷口癒合等方面起到重要作用，因此受到了廣大眼科學者的關注，尤其是近年來有關乾眼症患者角膜神經數量和形態變化的研究層出不窮，但其結論不盡相同。有研究表明乾眼患者的角膜敏感性下降[15,16]，但另有研究發現乾眼者角膜感覺過敏[17,18]。類似地，關於乾眼症對基底層下神經密度影響的研究也得到了不同的結果。一些研究者觀察到SS及非SS相關性乾眼症角膜基底層下神經密度均顯著低於對照組[10,16,18]。與此相反，另有一些研究並未發現基底層下神經密度的變化[5,15]，甚至還有研究證明SS患者的角膜神經密度增加[19]。這些關於角膜敏感性與基底層下神經密度相關性的研究之所以得出各異的結果可能是因為各項研究所納入的患者其乾眼症病情分級和嚴重程度不同[20]。儘管如此，就乾眼症患者角膜神經的形態改變而言，各項研究均提示基底層下神經的彎曲度及反光程度增加[10]。此外，有研究者發現SS及非SS相關性乾眼患者角膜基底層下神經串珠形成數量明顯增加。這些特殊結構可能是含有代謝活性遞質的神經纖維，其有助於角膜上皮營養異常情況的改善[5,8]；或者說神經串珠的形成代表了神經的損傷，從而需要通過炎症反應來分泌神經生長因子促進修復[10]。
　　（四）角膜免疫與炎症細胞
　　朗格漢斯細胞（Langerhans cells, LCs）是上皮的樹突狀細胞（dendritic cells, DCs），它們是角膜專職的抗原提呈細胞。它們通過誘導耐受或激活T淋巴細胞以及招募其它免疫及炎症細胞到角膜對抗病原體來控制炎症，是免疫力中的重要組成部分。正常人上皮DCs的分佈從角膜周邊到中央逐漸減少，其一般位於基底層下神經叢附近[21,22]。Lin等人[22]使用IVCM對乾眼症患者角膜中DCs及其它免疫和炎症細胞的密度及分佈進行了觀察。他們發現SS及非SS相關性乾眼症患者角膜中央的DCs密度分別為127.9±23.7/mm2和89.8±10.8/mm2，其均顯著高於正常受試者（34.9±5.7/mm2）（P＜0.05）；此外，他們還證明SS患者周邊角膜的DCs密度明顯增加（157.2±29.7/mm2）（P＜0.05），而非SS相關性乾眼症患者組（106.9±10.5/mm2）與正常對照組（90.7±8.2/mm2）相比僅有輕度增加（P＞0.05）。他們還發現在健康受試者的角膜當中，非樹突狀白細胞很少（中央1.6±0.6/mm2，周邊4.3±1.3/mm2）；但SS患者角膜中央及周邊的非樹突狀白細胞均顯著增加，分別為49.0±12.9/mm2和84.2±36.8/mm2；而非SS相關性乾眼症患者角膜中央的白細胞密度僅有輕度增加（4.6±1.0/mm2），但周邊無明顯變化（8.4±3.1/mm2）。上述發現證明SS及非SS相關性乾眼症患者中央及周邊角膜的上皮DCs和其它炎症細胞的密度增加，尤以SS患者更為明顯；這也從某種角度提示了乾眼症可被認為是一種局部的慢性炎症，眼表的保護性免疫調節機制和促炎反應兩者間的失衡進一步導致了組織的損傷[23]。
　　二、結膜
　　結膜上皮層內的杯狀細胞（goblet cells, GCs）可以分泌黏液，溼潤角膜、結膜，起到保護作用，此外瞼結膜尚有副淚腺存在，因此通過IVCM研究乾眼患者的結膜情況具有一定的臨床意義。結膜GCs在IVCM下表現為較大的高反光卵圓形細胞，其亮度相對均勻，因此較易被識別[22]。對結膜內的其它細胞進行定量觀察發現，SS及非SS相關性乾眼患者的結膜炎症細胞浸潤密度明顯高於對照組（P＜0.001），而且結膜炎症細胞的密度與淚膜穩定性及淚液量呈負相關，與眼表染色評分則呈正相關；但SS及非SS相關性乾眼患者的結膜上皮細胞密度明顯低於對照組（P＜0.05）；此外，SS患者結膜上皮囊泡顯著增多，這些結構與結膜虎紅染色陽性區域是相對應的[25]。Kojima等人[26]還發現結膜印跡細胞學檢查中的結膜上皮細胞核漿比以及平均單個上皮細胞面積的數值與IVCM的相應指標測量值具有良好相關性，因此他們認為IVCM可作為評價乾眼症患者結膜上皮細胞改變的有效非侵入性工具。
　　三、瞼板腺
　　瞼板腺功能障礙（meibomian gland dysfunction, MGD）時其分泌脂質的質和量將發生改變，從而引起脂質缺乏性乾眼。使用IVCM對乾眼症患者進行觀察發現其瞼板腺結構及數量均有不同程度的改變。Villani等人[27]證明與對照組相比，SS患者的瞼板腺泡壁及腺泡周圍間質結構在IVCM圖像中呈不均質性改變；進一步測量發現SS患者的瞼板腺泡略有擴張，其中原發性SS（SSI）和繼發性SS（SSII）組的平均腺泡直徑分別為53±31um和70±42um，與對照組（53±14um）相比無顯著性差異；但SSI和SSII患者的瞼板腺開口直徑別為27.8±5.9um和20.6±5.1um，兩者均明顯小於對照組（34.7±4.3um）；此外，SSI患者的瞼板腺泡密度明顯增加（138±69/mm2），但SSII患者則明顯減少（97±43/mm2）；而就眼表脂質層的反光度（分為1-4級）來說，SSI和SSII組分別為1.7±0.6和2.2±0.8，均顯著高於對照組（1.1±0.7）。除上述發現外，還有學者對MGD患者的瞼板腺進行了IVCM成像檢查，經分析研究發現功能障礙的瞼板腺表現為腺體周圍間質明顯的不均質性改變，由脂質分泌濃縮和腺體萎縮伴腺周纖維化所致的腺泡壁擴張，腺體導管上皮的超角化，以及腺體周圍炎症細胞的廣泛浸潤[28,29]。因此有學者認為可將腺體周圍炎症細胞計數作為監測MGD治療的有效指標[30]。
　　四、討論與總結
　　近年來IVCM的發展使得活體細胞形態的實時研究和顯微鏡分辨率下對眼表各種細胞進行評估成為可能。這一光學斷層掃描技術使人們可以觀察到上皮細胞、角膜基質細胞、角膜神經、內皮細胞、杯狀細胞、瞼板腺、以及免疫和炎症細胞等以前用裂隙燈檢查看不見的細微結構並進行分析。因此，它不但可被用於診斷，還可作為乾眼症患者監測病情和衡量治療效果的有用工具。
　　IVCM所觀察到的乾眼症患者角膜上皮的變化，主要是由於表面細胞層剝落以及炎症介質作用所造成的[31]。角膜上皮的損傷可能與淚液蒸發過強所致的淚膜滲透壓升高有關，這可能會導致角膜上皮形態及促炎症性改變，同時使眼表穩態受到破壞[11]。IVCM還可以觀察到SS患者角膜基質細胞存在異常高反光，它們被視為“激活狀態”的角膜基質細胞，但由於目前尚不存在明確的標準來辨別角膜基質細胞和定居或遊走性的角膜基質骨髓來源的細胞，因此在計數以及解讀這些高反光細胞的意義時應持謹慎態度。IVCM研究已證實幹眼症患者基底層下神經的密度會發生明顯變化，且具有異常的形態學表現，如串珠樣結構形成、出芽、扭曲、不規則分支形式、神經瘤樣結構增加，這些表現可以用神經退行性改變及再生來解釋[5]。在過去的幾年當中，人們已逐漸認識到炎症在乾眼症中所起的作用，而IVCM所觀察到的上皮DCs密度增加可能提示乾眼症患者角膜免疫狀態的提升[22]。因此，對角膜中央炎症細胞的密度進行動態評價可以用於乾眼嚴重程度的分級，並協助抗炎藥物療效的評價，從而指導臨床治療。
　　根據國際瞼板腺功能障礙研討會2011年的定義[32]，MGD主要由終末導管角化及阻塞所造成；瞼板腺阻塞可進一步導致腺體呈囊狀擴張、腺細胞萎縮、腺體減少以及低分泌狀態，但一般並不存在炎症反應。然而，IVCM圖像發現MGD患者不但存在腺體形態的改變，還存在廣泛性的腺體周圍炎症細胞浸潤[29]；該現象的臨床意義仍有待明確。儘管人們已經使用IVCM對乾眼症患者的角膜形態學改變作了廣泛的研究，但很少有關於乾眼症時結膜改變的研究。目前IVCM對結膜的研究還處於起始階段，亟需更為充分的實驗結果。
　　綜上所述，IVCM是一種非侵入性的檢查手段，它不但可以提供乾眼症相關的診斷信息，藉此對乾眼症患者進行病情程度分級，從而更好地協助治療，同時還能評估治療效果，更為準確地判斷疾病預後。因此IVCM的臨床價值應該受到重視，並通過進一步的深入研究來加以挖掘。