干眼症的体内共聚焦显微镜检查

　　【摘要】干眼症是最常见的眼部疾患之一。尽管在过去的几年中，与其相关的基础与临床研究获得了不少进展，但其病理生理机制仍不十分明晰。活体共焦显微镜是一种非侵入性的眼部成像技术，它使得人们在细胞水平对眼表上皮细胞、免疫及炎症细胞、角膜神经、角膜基质细胞、以及睑板腺结构进行观察成为可能。因此，它可以帮助人们更好地理解干眼症的发病机制以及病理生理，从而协助该病的诊断和治疗。使用共焦显微镜可对干眼相关情况下的眼表结构作出评估，并对其改变进行量化，这样使得疾病在早期就能得到识别，并利于对患者的分层治疗。此外，动态地观察眼表共焦图像的变化还可以对干眼症的临床治疗效果进行监测，利于及时调整治疗方案，并较为准确地评估预后。
　　【关键词】干眼症；活体共焦显微镜；眼表；睑板腺
　　根据2007年国际干眼研讨会的定义，干眼症（dry eye syndrome, DES）是一种“导致不适症状、视觉障碍、泪膜不稳定伴潜在眼表损害的泪液和眼表的多因素疾病；它还伴有泪膜渗透压的升高和眼表炎症”[1]。由于缺乏统一的诊断试验及标准，干眼症的确切患病率尚未可知；但据估计，50岁以上的人群当中，干眼症的患病率约为5％-30％，且随着人口老龄化的进展，其必将继续增长[2]。此外，干眼症的病理生理机制仍需深入研究，且自2002年以来美国所有关于干眼症新疗法的临床试验均以失败告终，上述情况均给眼科医师们出了难题。
　　角膜活体共焦显微镜（in vivo confocal microscopy, IVCM）是一种具有高分辨率的新型非侵入性的眼表成像仪器。其独特的物理性质使人们对活体角膜各层进行细胞水平的观察成为可能，从而被日益广泛地用于多种角膜疾病的研究，如上皮病变、各种基质变性及营养不良疾病、内皮病变、角膜沉积物、感染和外伤病灶等[3]。使用IVCM对干眼症患者的角膜上皮、角膜基质细胞、角膜神经及角膜内的免疫和炎症细胞等进行观察，不但可以进一步阐明干眼症的病理生理机制，还能够监测患者的病情变化从而评价治疗效果。
　　本文将对应用IVCM在干眼症患者中所观察到的角膜、结膜、睑板腺等结构的细胞水平变化作一总结陈述，以期对未来的相关研究有所启发。
　　一、角膜
　　干眼症患者眼表的炎性细胞因子和蛋白水解酶的产生增加/清除减少，从而对角膜各层细胞及神经等结构产生影响；而且已有研究证实干眼症患者的角膜厚度普遍明显变薄[4]。
　　（一）角膜上皮
　　在正常情况下，角膜上皮作为抵御病原体及其它有害物质的重要屏障，在眼表稳态中扮演重要角色；但在干眼症患者当中，角膜上皮的微结构改变明显。通过IVCM观察可见干燥综合征（sjogren's
　　syndrome, SS）性干眼患者的角膜表面上皮细胞形态不规则并伴有斑片状改变[5]；且Chen等人[6]发现干眼症患者表面角膜上皮不透明细胞的平均面积明显增大（P<0.0001< span="">），不透明细胞的面积与临床干眼指标，如视物模糊的症状（r=0.86,
　　P=0.0001）、结膜丽丝胺绿染色评分（r=0.4,
　　P=0.026）、角膜荧光素染色评分（r=0.5,
　　P=0.002）等存在明显相关性。此外，某些干眼症患者角膜上皮荧光素染色阳性，该体征经由IVCM观察证实是由于表面角膜上皮细胞异常，如紧密连接完整性受损、上皮通透性增加、以及细胞死亡等，其摄取荧光素增加所造成的，而非既往所认为的角膜上皮缺损处着染[7]。使用IVCM对角膜上皮进行定量观察发现，干眼症患者角膜上皮各层细胞密度可能发生变化[8-11]：普遍认为患眼表面及中间上皮细胞密度显著减小，但基底上皮层细胞的密度变化则存在争议，不同研究显示其密度可能增大或减小，也可能无明显变化。
　　（二）角膜基质
　　某些角膜的IVCM观察研究发现，除了角膜上皮的微结构改变，干眼症患者的角膜基质细胞也会发生形态及数量方面的变化。Tuominen等人[5]发现，SS患者角膜基质层变薄，且其角膜基质细胞存在异常高反光；后续研究相继显示，与健康对照组相比，甲亢眼病相关性干眼[12]以及类风湿关节炎伴SS患者[13]角膜基质中的异常高反光细胞明显增多；虽然不少研究者认为这些高反光细胞是呈“激活状态”的角膜基质细胞[14]，但这些细胞是否可能为骨髓间质来源的细胞还有待证实。此外，Benítez del Castillo等人[8]的研究提示SS相关性干眼患者角膜前基质层的细胞密度（1348±220/mm2）明显高于非SS相关性干眼患者（1183±273/mm2）以及N＜60岁（1107±210/mm2）和N≥60岁组（1075±201/mm2）；但就后基质层细胞密度而言，SS相关性干眼患者（808±117/mm2）、非SS相关性干眼患者（795±150/mm2）、N＜60岁（741±142/mm2）和N≥60岁（768±119/mm2）各组间则不存在统计学显著性差异。类似地，Villani等人[13]的研究则提示类风湿关节炎伴或不伴SS组的角膜前、后基质层细胞密度均明显高于健康对照组患者（P＜0.001）。
　  （三）角膜神经
　　由于角膜神经在调节角膜感觉、上皮完整性、细胞增生、伤口愈合等方面起到重要作用，因此受到了广大眼科学者的关注，尤其是近年来有关干眼症患者角膜神经数量和形态变化的研究层出不穷，但其结论不尽相同。有研究表明干眼患者的角膜敏感性下降[15,16]，但另有研究发现干眼者角膜感觉过敏[17,18]。类似地，关于干眼症对基底层下神经密度影响的研究也得到了不同的结果。一些研究者观察到SS及非SS相关性干眼症角膜基底层下神经密度均显著低于对照组[10,16,18]。与此相反，另有一些研究并未发现基底层下神经密度的变化[5,15]，甚至还有研究证明SS患者的角膜神经密度增加[19]。这些关于角膜敏感性与基底层下神经密度相关性的研究之所以得出各异的结果可能是因为各项研究所纳入的患者其干眼症病情分级和严重程度不同[20]。尽管如此，就干眼症患者角膜神经的形态改变而言，各项研究均提示基底层下神经的弯曲度及反光程度增加[10]。此外，有研究者发现SS及非SS相关性干眼患者角膜基底层下神经串珠形成数量明显增加。这些特殊结构可能是含有代谢活性递质的神经纤维，其有助于角膜上皮营养异常情况的改善[5,8]；或者说神经串珠的形成代表了神经的损伤，从而需要通过炎症反应来分泌神经生长因子促进修复[10]。
　　（四）角膜免疫与炎症细胞
　　朗格汉斯细胞（Langerhans cells, LCs）是上皮的树突状细胞（dendritic cells, DCs），它们是角膜专职的抗原提呈细胞。它们通过诱导耐受或激活T淋巴细胞以及招募其它免疫及炎症细胞到角膜对抗病原体来控制炎症，是免疫力中的重要组成部分。正常人上皮DCs的分布从角膜周边到中央逐渐减少，其一般位于基底层下神经丛附近[21,22]。Lin等人[22]使用IVCM对干眼症患者角膜中DCs及其它免疫和炎症细胞的密度及分布进行了观察。他们发现SS及非SS相关性干眼症患者角膜中央的DCs密度分别为127.9±23.7/mm2和89.8±10.8/mm2，其均显著高于正常受试者（34.9±5.7/mm2）（P＜0.05）；此外，他们还证明SS患者周边角膜的DCs密度明显增加（157.2±29.7/mm2）（P＜0.05），而非SS相关性干眼症患者组（106.9±10.5/mm2）与正常对照组（90.7±8.2/mm2）相比仅有轻度增加（P＞0.05）。他们还发现在健康受试者的角膜当中，非树突状白细胞很少（中央1.6±0.6/mm2，周边4.3±1.3/mm2）；但SS患者角膜中央及周边的非树突状白细胞均显著增加，分别为49.0±12.9/mm2和84.2±36.8/mm2；而非SS相关性干眼症患者角膜中央的白细胞密度仅有轻度增加（4.6±1.0/mm2），但周边无明显变化（8.4±3.1/mm2）。上述发现证明SS及非SS相关性干眼症患者中央及周边角膜的上皮DCs和其它炎症细胞的密度增加，尤以SS患者更为明显；这也从某种角度提示了干眼症可被认为是一种局部的慢性炎症，眼表的保护性免疫调节机制和促炎反应两者间的失衡进一步导致了组织的损伤[23]。
　　二、结膜
　　结膜上皮层内的杯状细胞（goblet cells, GCs）可以分泌黏液，湿润角膜、结膜，起到保护作用，此外睑结膜尚有副泪腺存在，因此通过IVCM研究干眼患者的结膜情况具有一定的临床意义。结膜GCs在IVCM下表现为较大的高反光卵圆形细胞，其亮度相对均匀，因此较易被识别[22]。对结膜内的其它细胞进行定量观察发现，SS及非SS相关性干眼患者的结膜炎症细胞浸润密度明显高于对照组（P＜0.001），而且结膜炎症细胞的密度与泪膜稳定性及泪液量呈负相关，与眼表染色评分则呈正相关；但SS及非SS相关性干眼患者的结膜上皮细胞密度明显低于对照组（P＜0.05）；此外，SS患者结膜上皮囊泡显著增多，这些结构与结膜虎红染色阳性区域是相对应的[25]。Kojima等人[26]还发现结膜印迹细胞学检查中的结膜上皮细胞核浆比以及平均单个上皮细胞面积的数值与IVCM的相应指标测量值具有良好相关性，因此他们认为IVCM可作为评价干眼症患者结膜上皮细胞改变的有效非侵入性工具。
　　三、睑板腺
　　睑板腺功能障碍（meibomian gland dysfunction, MGD）时其分泌脂质的质和量将发生改变，从而引起脂质缺乏性干眼。使用IVCM对干眼症患者进行观察发现其睑板腺结构及数量均有不同程度的改变。Villani等人[27]证明与对照组相比，SS患者的睑板腺泡壁及腺泡周围间质结构在IVCM图像中呈不均质性改变；进一步测量发现SS患者的睑板腺泡略有扩张，其中原发性SS（SSI）和继发性SS（SSII）组的平均腺泡直径分别为53±31um和70±42um，与对照组（53±14um）相比无显著性差异；但SSI和SSII患者的睑板腺开口直径别为27.8±5.9um和20.6±5.1um，两者均明显小于对照组（34.7±4.3um）；此外，SSI患者的睑板腺泡密度明显增加（138±69/mm2），但SSII患者则明显减少（97±43/mm2）；而就眼表脂质层的反光度（分为1-4级）来说，SSI和SSII组分别为1.7±0.6和2.2±0.8，均显著高于对照组（1.1±0.7）。除上述发现外，还有学者对MGD患者的睑板腺进行了IVCM成像检查，经分析研究发现功能障碍的睑板腺表现为腺体周围间质明显的不均质性改变，由脂质分泌浓缩和腺体萎缩伴腺周纤维化所致的腺泡壁扩张，腺体导管上皮的超角化，以及腺体周围炎症细胞的广泛浸润[28,29]。因此有学者认为可将腺体周围炎症细胞计数作为监测MGD治疗的有效指标[30]。
　　四、讨论与总结
　　近年来IVCM的发展使得活体细胞形态的实时研究和显微镜分辨率下对眼表各种细胞进行评估成为可能。这一光学断层扫描技术使人们可以观察到上皮细胞、角膜基质细胞、角膜神经、内皮细胞、杯状细胞、睑板腺、以及免疫和炎症细胞等以前用裂隙灯检查看不见的细微结构并进行分析。因此，它不但可被用于诊断，还可作为干眼症患者监测病情和衡量治疗效果的有用工具。
　　IVCM所观察到的干眼症患者角膜上皮的变化，主要是由于表面细胞层剥落以及炎症介质作用所造成的[31]。角膜上皮的损伤可能与泪液蒸发过强所致的泪膜渗透压升高有关，这可能会导致角膜上皮形态及促炎症性改变，同时使眼表稳态受到破坏[11]。IVCM还可以观察到SS患者角膜基质细胞存在异常高反光，它们被视为“激活状态”的角膜基质细胞，但由于目前尚不存在明确的标准来辨别角膜基质细胞和定居或游走性的角膜基质骨髓来源的细胞，因此在计数以及解读这些高反光细胞的意义时应持谨慎态度。IVCM研究已证实干眼症患者基底层下神经的密度会发生明显变化，且具有异常的形态学表现，如串珠样结构形成、出芽、扭曲、不规则分支形式、神经瘤样结构增加，这些表现可以用神经退行性改变及再生来解释[5]。在过去的几年当中，人们已逐渐认识到炎症在干眼症中所起的作用，而IVCM所观察到的上皮DCs密度增加可能提示干眼症患者角膜免疫状态的提升[22]。因此，对角膜中央炎症细胞的密度进行动态评价可以用于干眼严重程度的分级，并协助抗炎药物疗效的评价，从而指导临床治疗。
　　根据国际睑板腺功能障碍研讨会2011年的定义[32]，MGD主要由终末导管角化及阻塞所造成；睑板腺阻塞可进一步导致腺体呈囊状扩张、腺细胞萎缩、腺体减少以及低分泌状态，但一般并不存在炎症反应。然而，IVCM图像发现MGD患者不但存在腺体形态的改变，还存在广泛性的腺体周围炎症细胞浸润[29]；该现象的临床意义仍有待明确。尽管人们已经使用IVCM对干眼症患者的角膜形态学改变作了广泛的研究，但很少有关于干眼症时结膜改变的研究。目前IVCM对结膜的研究还处于起始阶段，亟需更为充分的实验结果。
　　综上所述，IVCM是一种非侵入性的检查手段，它不但可以提供干眼症相关的诊断信息，借此对干眼症患者进行病情程度分级，从而更好地协助治疗，同时还能评估治疗效果，更为准确地判断疾病预后。因此IVCM的临床价值应该受到重视，并通过进一步的深入研究来加以挖掘。