為了診斷乳糖不耐症，我們可以讓腸道攝入超過其功能極限的奶製品，典型的臨床症狀將出現在30分鐘後，不過若有其他食物或運動因素影響的話可能要1到2個小時。臨床反應(症狀例如：反胃、痙攣、鼓脹、腹瀉或胃氣脹)會存在差異，嚴重程度也因人而異。
為了確診的需要，對乳糖不耐與牛奶過敏進行區分是很重要的，後者是人體對乳蛋白不正常的免疫反應。由於乳糖不耐症對於世界上的多數成年人來說是正常的身體狀況，所以我們並不認為它是一種疾病，一般來說也不需要去進行醫學診斷。無論如何，如果必需要確認是否患有乳糖不耐症的話，這裡有三種檢測方法：
氫呼氣測試
在做氫呼氣試驗前12小時須禁食，然後攝入50克乳糖(以水稀釋)。如果乳糖不能被消化，那麼腸道細菌將分解乳糖產生代謝變化，並製造氫氣與甲烷，通過病人的呼氣，這些氣體可以用氣相色譜儀檢測到。這項試驗需要2到3個小時。果糖吸收障礙也會產生與此相類似的症狀。
糞便酸性測試
這項測試適用於嬰兒，因為其他測試對嬰兒有風險而且不太實際。
腸道活組織檢查
腸道活組織檢查可以在氫呼氣測試之後進行以便確診。不過，鑑於這項檢查要“侵入人體”，而且也需要高度專業的實驗室來測定"乳糖酶"及"訊息核糖核酸"(mRNA)，這項檢查方法一般只用於臨床研究。 建議你寶寶去醫院檢查，確診。
