鹼性成纖維細胞生長因子對人類晶狀體上皮的影響

　　目的：為研究鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及其受體抗體對人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells, HLECs)超微結構的影響。
　　方法：採用透射電鏡觀察正常HLECs及bFGF作用後及受體抗體阻斷bFGF在HLECs作用的超微結構變化。
　　結果：正常HLECs胞內較多的線粒體、粗麵內質網和遊離核糖體及少量微絲結構，核膜完整，染色質均勻。bFGF作用後表現為細胞膜完整，膜局部突起較多，線粒體和遊離核糖體明顯增多，基質較緻密，細胞核附近有較多微絲結構，核膜完整，染色質均勻，核仁增大。bFGF受體抗體阻斷作用後表現為細胞突起消失、細胞膜明顯破壞，大量線粒體空化，嵴消失，基質減少，呈雲霧狀退化，內質網明顯減少至消失，核膜破壞明顯，有的細胞結構不清，趨於死亡。
　　結論：bFGF對HLECs的促增殖作用可被FGF受體抗體所阻斷。
　　後囊混濁的發生與術後晶狀體上皮細胞增殖、遷移及纖維化有關，在晶狀體後囊變化與生長因子的作用密切相關，尤其是鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)受體的作用更不容忽視。阻斷FGF受體可抑制bFGF對HLECs增殖作用[1]，我們對其作用使細胞超微結構發生變化進行研究。
　　1、材料和方法
　　1.1、胎兒晶狀體上皮細胞培養  同一個胎兒新鮮的2個眼球，生理鹽水充分沖洗乾淨，再用慶大黴素沖洗，置乾淨的玻璃器中，清除眼球周圍組織，剪去結膜。用已稀釋的慶大黴素溶液充分沖洗已處理的眼球，置另一干淨的玻璃培養器中，在超淨工作臺上距角膜緣約4cm處環形剪開鞏膜，移去上部（角膜用作培養角膜上皮細胞）後取出晶狀體。沿晶狀體赤道部分離出前囊膜，放入27mm直徑的塑料培養皿，細胞面朝皿底，加幾滴合150g/L DMEM培養液（pH 7．2），用虹膜剪子將囊膜儘量剪成碎塊，展平並分散開後放入CO2箱（日本SANTO公司MCO17AI）中約4h，然後，輕輕地補加培養液約2.5mL，繼續培養（培養條件為37℃，50mL/L CO2，飽和溫度。每日顯微鏡下觀察細胞生長情況，7～10d更換培養液。
　　傳代培養：當細胞生長融合時，吸出培養液，用Hanks液沖洗2次，加2.5g/L胰蛋白酶溶液1.5mL，消化4～8min吸出，加入含150g/L FCF DMEM培養液反覆吹打，使細胞懸浮，公佈均勻，然後分至幾個培養皿繼續培養。
　　1.2、細胞標本的製備  使用2代細胞進行實驗。將切成小塊的蓋玻片消毒後放在27mm直徑的玻璃培養器內，將胎兒晶狀體上皮細胞、加入bFGF（100μg/L）細胞及加入bFGF（100μg/L）和bFGF受體抗體（5mg/L）的細胞懸液分別滴在培養器內的蓋玻片小塊上，製成3個不同樣本，放入CO2培養箱內4d。
　　1.3、透射電鏡標本製作  待蓋玻片長滿細胞，棄去培養液，用Hanks液沖洗2次。用橡皮刮刀將貼壁生長的細胞刮下，離心後去除上清，30g/L戌二醛固定後，加入10g/L鋨酸固定，乙醇逐級脫水，Epon812滲透包埋，60℃溫箱內聚合72h，LKBB400型超薄切片機切片，醋酸鈾和枸酸鉛雙染，於philips EM 400T透射電鏡下觀察並照像。
　　2、結果
　　2.1、胎兒晶狀體上皮細胞  胎兒晶狀體上皮細胞（2代）表現胞內正常的線粒體、粗麵內質網、遊離核糖體及少許微絲結構；核膜完整，染色質均勻，細胞器數目有限，提示了HLECs功能尚可，但其有增殖能力差的特點。
　　2.2、加入bFGF（100μg/L）的胎兒晶狀體上皮細胞  在胎兒晶狀體上皮細胞培養中加入bFGF，其細胞超微結構為：細胞膜完整，局部突起較多，呈短棒或指狀；胞內較豐富的細胞器，尤其可見功能良好的線粒體明顯增多，基質亦較緻密，並見遊離核糖體增多，近核附近有較多沿細胞長軸平行排列的微絲結構；核膜完整，染色質粗大、均勻，核仁增大。細胞器增多，說明了加入bFGF後，其對細胞發揮了促增殖作用，使細胞的代謝功能旺盛，有絲分裂能力增強；同時說明了bFGF對此細胞亦有一定的分化效應，如超微結構見到沿長軸排列的微絲結構，是細胞分化後典型的特徵。
　　2.3、加入bFGF（100μg/L）和FGF受體抗體（5mg/L）胎兒晶狀體上皮細胞  同時加入bFGF和FGF受體抗體時，細胞超微結構表現為細胞突起消失，膜明顯破壞，大量線粒體空化，嵴消失，基質減少，呈雲霧狀退化，內質網亦明顯減少甚至消失，僅有少量微絲並呈斷裂狀，細胞器明顯減少、破壞，有的消失；核膜破壞明顯；有的細胞結構不清甚至趨於死亡，提示了抗體中和實驗bFGF受體被其抗體所拮抗，使bFGF的作用消失，細胞代謝基本消失，並趨向死亡狀態。
　　3、討論
　　晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一含有較多豐富細胞器的一種細胞，其環境也與其它的上皮細胞不同，它對維持晶狀體代謝起著重要作用。前囊中央的上皮細胞相對靜止，赤道部的上皮細胞卻在人的一生中不斷增殖且向晶狀體的前後極延伸、逐漸分化成晶狀體纖維細胞並形成晶狀體的多層結構，而在此過程中細胞體拉長，細胞器減少等變化。
　　文獻報導，對晶狀體的電鏡觀察，發現前囊與赤道部的囊膜與晶狀體細胞緊密連接，後囊較薄，無細胞結構。晶狀體上皮細胞由於有大量微絨毛存在而擴大了細胞的表面積，為該部細胞與房水之間的物質交換提供了場所，因而也加快了晶狀體纖維與房水之間物質交換過程。線粒體在機能狀態良好的細胞中呈桿狀或卵圓狀，數量較多，當機能低下或代謝不良時能變成顆粒狀或集聚成更大的團粒；微管和微絲構成了細胞質骨架，它們除與支持細胞形態和與細胞運動有關外，對細胞膜的運動如吞飲、免疫反應等都有影響。
　　一般來說，已經纖維化的拉長細胞對bFGF的反應能力是不同的，細胞拉長也表明了是與早期纖維分化活動相一致的。後囊下發生白內障時，周圍晶狀體上皮細胞向後方移行而形成多層的斑狀、腫脹細胞和一些拉長的細胞，這時，豐富的囊膜樣基質積累於囊膜下面和細胞之間，還有重要的粗麵內質網、高爾基複合體、微絲以及明顯的囊膜皺褶和凋亡細胞的變化；這與白內障術後後囊混濁的相似變化有一定的聯繫。而最近對前囊混濁的研究，也得出相似結果。
　　本實驗通過透射電鏡觀察發現，加入bFGF後，細胞器增多，說明了其對細胞發揮了促增殖作用，使細胞的代謝功能旺盛，有絲分裂能力增強，同時說明了bFGF對此細胞亦有一定的分化效應，如超微結構見到沿長軸排列的微絲結構，是細胞分化後典型的特徵。在相同條件下，加入bFGF同時加入FGF受體抗體時，細胞器明顯減少、破壞，有的消失，核膜破壞明顯，有的細胞結構不清甚至趨於死亡，提示了抗體中和實驗bFGF受體被其抗體所拮抗，使bFGF的作用消失，細胞代謝基本消失，並趨向死亡狀態。成纖維細胞生長因子受體由細胞外配體區、螺旋狀跨膜區和胞內區組成，四種FGF受體基因可產生48種受體異構體。FGFR1在晶狀體上皮細胞中表達隨年齡的增加而減少，但FGF作用後FGFR1的表達增強，在細胞發育和纖維化中起重要作用。無論以何種方式阻斷FGF受體，都可抑制晶狀體細胞的增殖。電鏡觀察發現，實驗證明，bFGF在維持囊膜對晶狀體上皮細胞的支持方面起重要作用。bFGF對晶狀體細胞的促增殖作用是其與FGF受體結合後通過MAPK/ERK信號系統而起作用的。bFGF與其受體在晶狀體上皮細胞增殖、分化方面起重要作用。我們的結果從超微結構證實了bFGF對HLECs的促增殖作用及這種作用可以被其受體的抗體所阻斷的效應；同時亦從微觀上間接的提示bFGF發揮其生物學效應是通過與細胞表面的受體結合而實現的。為體內實驗從分子水平上闡述bFGF作用及“受體結合”學說提供了依據。