為廣譜抑菌劑。通過脂溶性可彌散進入細菌細胞內,主要作用於細菌70s核糖體的50s亞基,抑制轉肽酶,使肽鏈的增長受阻,抑制了肽鏈的形成,從而阻止蛋白質的合成。高濃度時或對本品高度敏感的細菌也呈殺菌作用。
氯黴素一般對革蘭氏陰性菌作用較革蘭氏陽性菌強。敏感菌有腸桿菌科細菌(如大腸桿菌、產氣腸桿菌、克雷伯氏菌、沙門氏菌等)及炭疽桿菌、肺炎球菌、鏈球菌、李斯特氏菌、葡萄球菌等。衣原體、鉤端螺旋體、立克次體也對本品敏感。本品對厭氧菌如破傷風梭菌、產氣莢膜桿菌、放線菌及乳酸桿菌、梭桿菌等也有相當作用。但對綠膿桿菌、結核桿菌、病毒、真菌等均無效。
細菌對氯黴素有發展緩慢的耐藥性,主要產生乙酰轉移酶。通過質粒傳遞而獲得。某些細菌的一些菌株(綠膿桿菌、變形桿菌、克雷伯菌等)也因改變了細菌胞壁通透性,使氯黴素不能進入菌體而耐藥。