甚麼是肝纖維化基因治療

　　肝纖維化(Liver fibrosis)是肝臟受到損害因子長期刺激的結果，並將最終演變為肝硬化。隨著對肝纖維化分子機制認識的深入，肝纖維化是一個可逆的過程已逐漸被大家認可。現代基因治療技術的進步為肝纖維化和肝硬化的治療帶來了新的希望。1995年，美國國立衛生研究院（NIH）在總結以往基因治療的經驗後指出，發展載體技術、疾病分子機制研究和發展動物模型應成為基因治療研究的正確方向。本文著重就肝纖維化的分子機制研究和載體技術在肝纖維化基因治療中的應用作一綜述。
　　1、針對肝纖維化分子機制進行的基因治療研究
　　1.1 肝星狀細胞的調控
　　肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC)的活化和增殖是肝纖維化發生發展的中心環節和共同通路。活化HSC表達α-平滑肌肌動蛋白 （smooth muscle-alpha，α-SMA） 和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。活化的HSC可分泌I、III、IV型膠原、層粘蛋白等多種纖維化過程中的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分，活化的HSC還可以分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制物基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP），引起ECM降解相對不足，過多沉積在肝內，導致肝纖維化形成。因此HSC的活化與增殖調控是肝纖維化基因治療的重要途徑。
　　1.1.1 抑制HSC的活化
　　由於肝臟的氧化應激和炎症反應是肝纖維化發生的始動環節，諸多炎症因子都可活化HSC，導致肝纖維化的發生發展。研究發現，水飛薊素（Silybum）、從豆類中提煉出的磷脂酰膽鹼（phosphatidylcholine）、S腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine）等抗氧化劑可通過抑制HSC的活化而減輕肝纖維化的程度。IFN-α  能夠抑制HSC的活化，並能直接抑制ECM的合成。Chen等實驗證實IFN-α  能夠有效抑制HSC的活化，同時使HSC細胞中α-SMA的表達量和TIMP-1、轉化生長因子（TGF-β）的mRNA水平降低。
　　其他一些細胞因子如曲古抑菌素A、甘草酸 、棕櫚酸視黃醇和白藜蘆醇等，也被證實能抑制HSC的活化。
　　TGF--β是HSC活化最有效的刺激因子。肝損傷時，ECM釋放TGF-β，TGF-β 能夠促進HSC活化，但抑制HSC的增殖，同時抑制肝細胞增殖，誘導肝細胞凋亡；TGF-β 通過Smad信號通路促進膠原合成，抑制MMP合成，促進TIMP的合成；而MMP合成的減少將導致ECM降解不足，致使ECM積累。一些抗TGF-β 受體在動物實驗模型中都獲得了較好的效果，絲氨酸蛋白酶抑制劑可以阻止TGF-β 的活化；Smad-7轉移因子可以阻斷TGF-β在細胞內的信號通路；我們的研究也證實，通過RNA干擾TGF-β傳導通路上的Smad-2的表達，抑制TGF-β對HSC的活化。
　　過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（Peroxisome proliferator activator receptor gamma，PPAR-γ)能夠控制細胞的生長和分化，噻唑烷二酮類作為PPAR-γ 配體可以抑制HSC的活化和促進纖維溶解。卡託普利（血管緊張素轉換酶抑制劑）和坎地沙坦（血管緊張素II受體拮抗劑）同樣可通過作用於HSC，促進纖維溶解而減輕肝纖維化的程度。
　　1.1.2 抑制HSC的增殖
　　血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF-I）等在急、慢性肝臟損傷情況下可通過酪氨酸激酶受體信號途徑促進HSC增殖。其中PDGF尤為重要，磷酸二酯酶抑制劑3-7-二甲基黃嘌呤可阻斷PDGF相關的HSC有絲分裂。三硝基苯基（TNP-470）的抗血管生成特性也可抑制HSC增殖。而小分子酪氨酸激酶受體抑制劑有望通過進一步修飾而應用於肝纖維化治療。
　　1.1.3 誘導HSC凋亡
　　肝纖維化自發性逆轉主要依賴HSC的凋亡，HSC凋亡後數量減少，ECM分泌減少，TIMPs合成下降，MMPs活性增加，ECM降解增加，從而促進肝纖維化逆轉。HSC凋亡調控機制複雜，死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網途徑是介導HSC凋亡最為重要的途徑。
　　HSC表達許多細胞表面死亡受體，如Fas配體、TNF-α、神經生長因子（nerve growth factor，NGF） 等均可作用於相應受體而在體外誘導HSC凋亡；地西泮通過作用於線粒體孔道外周型苯二氮卓受體（PBR）而促進HSC凋亡；支黴菌素和柳氮磺胺吡啶通過抑制核轉錄因子（NF-κB）而促進HSC凋亡。
　　1.2  促進細胞外基質的降解
　　ECM的合成與降解失衡、基質的重構和間質型膠原成分Ⅰ/Ⅲ型膠原等異常增多沉積是肝纖維化的病理基礎。因此，增加膠原酶的基因表達，調節內源性膠原酶的生物活性，降解增多的ECM是逆轉肝纖維化進程的關鍵。
　　MMPs是一組能降解ECM的蛋白分解酶,在ECM降解過程中起關鍵作用，MMPs的活性與其特異性抑制因子TIMPs在組織中的表達密切相關。目前，MMPs和TIMPs已成為肝纖維化基因治療的重要靶點。MMPs家族按底物不同主要有間質膠原酶、明膠酶、間質溶解素和膜型MMPs（MT-MMPs）4類。目前已發現的 TIMPs 包括 TIMP-1、-2、-3、-4四種，都可與特定的活性MMP結合成1:1複合物，抑制後者對 ECM 的降解活性。
　　研究發現，將MMPs的表達質粒或TIMPs的反義寡核苷酸質粒轉染肝纖維化大鼠，可促進Ⅰ/Ⅲ型膠原的降解,逆轉纖維化；生殖激素鬆弛酞（relaxin）也可通過下調TIMPs而減少HSC激活所致的膠原沉積；脯氨酸-4-羥化酶抑制劑可通過抑制TIMPs的作用，相對提高MMPs的活性，從而促進ECM降解，逆轉肝纖維化。
　　尿激酶型纖溶酶原的激活物(urokinase plasminogen activator，uPA)是ECM裂解蛋白級聯的始動因子,同時uPA也可使肝細胞生長因子（HGF）的表達增加,上調MMP的活性，促進肝纖維化的逆轉和肝細胞再生。
　　2、載體技術在肝纖維化基因治療中的應用
　　有效的基因轉移是基因治療的關鍵，細胞因子如何能在靶細胞中發揮最大的效力，選擇合適的載體顯得極為重要。理想的載體應具備特異性高、親和力強、載基因容量大、整合轉染效率高、抗原性及毒性小和表達功能基因持續時間長等優點。
　　基因載體分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類。非病毒性載體包括脂質體包被DNA、多聚體（多聚賴氨酸複合物等）和重組乳糜微粒殘餘體等。非病毒性載體具有載基因容量大和抗原性較小、毒性小較為安全的優點，但同時它存在效率低且表達功能基因持續時間短的缺點，因此目前研究和使用的病毒性載體佔到全部載體的70％以上。
　　2.1 病毒性載體
　　目前認為，病毒性載體是基因轉移最為有效的工具，而逆轉錄病毒（retrovirus）、腺病毒（adenovirus）和腺病毒相關病毒(adeno associated virus ,AAV)是肝纖維化基因治療中最有希望的載體。
　　腺病毒載體為雙鏈DNA分子，決定了其理化性質穩定這一最大特點。腺病毒載體既可感染分裂細胞又可感染非分裂細胞，腺病毒轉送的目的基因產物表達量大,能達到治療水平。鑑於這些優點，腺病毒載體在肝纖維化基因治療的各個環節中得到了廣泛應用。Qi等構建了表達TGF-β II型受體胞外區的複製缺陷型腺病毒載體，以阻斷內源性TGF-β受體信號通路；Rederfeld等將MMP-9的突變體通過腺病毒載體轉導入CCl4誘導的BALB/c小鼠體內，使其與TIMP-1結合，達到敲減TIMP-1的目的；Salgado等構建缺陷型腺病毒介導非分泌性人uPA基因，誘導膠原酶表達。但腺病毒載體存在目的基因的表達持續時間短的缺點，同時由於腺病毒具有免疫源性，容易引起宿主的免疫反應和毒副作用。
　　AAV為單鏈非致病性DNA病毒,可定點整合入第19號染色體，在輔助病毒的協助下,AAV可進行產毒性感染。AAV既能感染正在分裂的細胞,也能感染相對靜止的細胞,而且還能在體內長期表達,不致病且無毒性，因此被視為一種理想的載體。Chen等構建AAV介導的人IFN-γ (hIFN-γ )表達載體，抑制HSC的活化；Tsui等將AAV介導的I型亞鐵血紅素加氧酶基因(HO-1)通過門靜脈注射到肝纖維化動物模型中，均獲得滿意的轉染效率和穩定表達。AAV的不足之處是載基因容量小,不能提供足夠的載體空間而限制其應用。
　　逆轉錄病毒屬於有包膜的RNA病毒，根據其基因組的結構可分為兩類：一類為簡單的逆轉錄病毒，如小鼠白血病病毒（MLV）；另一類為較複雜逆轉錄病毒，如慢病毒(lentivirus, LV）屬中的人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)。簡單的逆轉錄病毒最早應用肝纖維化的基因治療。由於它只能將外源基因轉移至增殖分裂的細胞，而對靜止細胞轉錄效果不佳，因此以往的學者不得不採用肝臟部分切除等損傷性手段來誘導肝細胞的分裂，且病毒顆粒穩定性較差、容納外源基因量小、易被補體迅速破壞等缺點限制了他的使用。
　　慢病毒是逆轉錄病毒科的成員。目前分離的慢病毒主要有:HIV，馬傳染性貧血病病毒(eqine infectious anemia virus,EIAV)和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)等。與其他逆轉錄病毒不同，慢病毒基因組結構複雜，除了含有gag、pol、env 等3個結構基因以及5'端和3'端LTR結構外，還包括4個輔助基因vif、vpr、nef、vpu 和2個調節基因tat和rev。病毒載體經改構後，不在宿主細胞內繁殖，不會導致宿主細胞死亡，被感染的或轉化的動物細胞能連續傳代，因此可利用慢病毒作載體改變動物細胞的基因型，並遺傳到子代。慢病毒載體最大的特點是在感染分裂期細胞的同時，還可以感染非分裂期細胞，並可在宿主體內長期表達，且不易誘發宿主免疫反應，安全性好。此外，由於慢病毒有強大的包裝能力，一般認為可達8～10kb，因此適用於多基因表達系統。多項在動物模型中進行的實驗均表明，肝細胞對LV介導的基因轉移易感，轉入的外源基因可長期表達。Zahler等研究發現，在原代培養的胎兒肝細胞中，LV的感染效率可以達到30 ％～40 ％。LV經過改造在體外可有效轉導原代培養的大鼠肝細胞和原代培養的人肝細胞。我們通過構建慢病毒介導的tTG基因RNA干擾質粒轉染大鼠原代HSC，已獲得穩定表達。基於在肝細胞基因轉導方面所具有的良好特性，慢病毒載體在肝纖維化基因治療中的應用已引起越來越多的關注，而且在不斷的改進中其安全性也逐漸得到保障。
　　2.2 載體的靶向性研究
　　選擇肝臟特異性靶向性載體逐漸受到重視，由於肝外組織器官也可能存在作用的靶點，因此強調治療作用的特異性、靶向性不但可以提高作用的效率而且可以降低對其他臟器的潛在毒性影響。研究證實，活化的HSC是唯一表達甘露糖-6-磷酸鹽受體和VI型膠原受體的細胞，因此，通過甘露糖-6-磷酸鹽對藥物進行修飾後可以達到靶向作用於HSC的目的。Inagaki等發現，將載體啟動子加入增強子序列COL1A2，在特異性增強子的作用下，外源基因僅在肝纖維化組小鼠活化HSC中表達,而在正常小鼠肝臟及其他器官中均未見表達。因此，進一步篩選針對肝臟實質和間質細胞高選擇性靶向性載體用於肝纖維化基因治療,將提高肝纖維化治療的針對性和高效性,提高抗肝纖維化治療的整體水平。
　　總之，隨著對肝纖維化分子機制認識的不斷深入,肝纖維化的基因治療已展現出良好的發展前景；同樣，載體技術的發展也為提高肝纖維化基因治療的靶向性、安全性和有效性提供了保障。但是，肝纖維化是多基因和多途徑調控的結果，而且目前大多數基因治療還僅僅侷限在動物實驗階段。因此，肝纖維化的基因治療研究任重而道遠，採用多環節聯合基因治療以及進一步提高載體系統的靶向性和安全性，是肝纖維化基因治療發展的重要方向。