分化型甲状腺癌的血清学诊断研究有哪些进展？

　　甲状腺结节是最常见的内分泌疾病之一，其中只有5％-15％转变成甲状腺癌。甲状腺癌（thyroid cancer ,TC）是最常见的的内分泌恶性肿瘤，占全身所有恶性肿瘤的1％，占头颈部恶性肿瘤的91.5％[1]。分化型甲状腺癌（DTC）约占全部甲状腺癌的90％以上，包括乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和滤泡状癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）。调查显示世界各地每年大约新增加122800例甲状腺癌，其中PTC的发病率上升尤为明显[2]。分化型甲状腺癌的预后与分期密切相关，因此早期诊断有重要意义。
　　目前许多诊断技术应用于甲状腺癌的临床早期诊断：超声、CT、MRI、PET/CT、细针吸取活检(fine needle aspiration biopsy ,FNAB）。通常超声引导下细针吸取活检被认为是术前诊断甲状腺癌最有效的方法，据报道FNAB有93％的敏感性和75％的特异性[3]。但是FNAB也存在局限性：结节直径小于１cm时，很难准确取得病变组织；细胞或组织量有限；属于有创检查。在不确定或怀疑恶性病变患者的术后病理发现,仅20％ ~25％为甲状腺癌,另外75％ ~80％的患者则接受了不必要的甲状腺手术[4]。如何通过无创手段准确而特异地早期诊断DTC一直是临床的热点和难点。近年来许多研究试图通过检测DTC患者血清中蛋白质的特异性表达改变，寻找DTC肿瘤标记物，来提高DTC早期诊断率，并且其中一些研究结果展示了良好的应用前景。
　　1、分化型甲状腺癌无目标血清蛋白质组学研究
　　目前许多研究发现DTC存在异常基因表达，在乳头状癌中存在BRAFV600E基因突变、RET/PTC1 基因重排、RAS突变和TRK等[5];在滤泡状癌中存在NRASQ61R突变、BRAFK601E突变、PAX8/PPARG 重排、RAS突变和RET/PTC 基因重排等[6]。这些突变基因不仅引起编码蛋白发生异常，同时还可以引起下游的相关信号通路活性改变，直接或间接影响到通路相关蛋白的翻译及翻译后加工修饰。寻找并分析肿瘤蛋白质差异，有可能发现DTC特异性肿瘤标志物。目前常见的蛋白质组学技术是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、表面增强激光解析电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）等。
　　蛋白质组学实验检查底物可以是组织也可以是血清，唾液等。Sofiadis A[7]（2010）和Becker S[8]（2012）分别应用SELDI-TOF-MS和二维凝胶电泳分析DTC组织样本和对照组样本之间表达的蛋白质差异，以此作为DTC诊断模型。但是组织中的蛋白差异并不等同于血清中的蛋白差异，同时肿瘤早期诊断得到的组织含量和性质都不定，容易产生假阴性结果，因此组织蛋白质组学并不适用于术前早期诊断。血清样本丰富，临床上血清抽取方便、快捷。血清蛋白质含量丰富（60C80 mg/ml），种类繁多（数百种）[9]。卢秀波等[10](2006)就发现甲状腺癌、甲状腺良性结节和健康人三组血清蛋白质表达各自有独特的差异，并且运用血清蛋白质组学技术可以建立特异度和敏感度较高的血清蛋白质指纹图谱模型。这表明蛋白质组学能够分析肿瘤和良性病变血清的差异，所以血清蛋白质组学可能在肿瘤早期诊断中更具优势。
　　自从2002年首次报道了运用蛋白质组学技术筛选出卵巢癌血清相关蛋白质标记物以来[11]，蛋白质组学技术已广泛用于人类多种肿瘤的研究,如肺癌[12],胰腺癌[13]，卵巢癌[14],乳腺癌[15],结肠癌等[16]。迄今国内外研究者利用蛋白质组学方法对分化型甲状腺癌患者的血清标本进行研究，筛选出一些有潜能的血清蛋白质标记物，或者建立了诊断DTC特异度和敏感度很高的血清蛋白质图谱模型。
　　1.1  基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）
　　MALDI-TOF-MS是传统的蛋白质分离鉴定技术。其原理是利用氮源脉冲激光使基质吸收激光的能量，从而使多肽样品离子化。多肽样品然后进入质量分析器,因质荷比差异发生电离,就可测量肽段离子的相关参数：肽质量指纹、肽序列标签或部分氨基酸序列,最后用相应的软件搜寻蛋白质组数据库,实现对蛋白质的定性鉴定或定量分析。
　　Andrew Martorella等[17](2007)则利用MALDI-TOF-MS分析鉴定出27例甲状腺癌和32例血清中98种有显著差异的血清肽组成血清肽指纹图谱，这种模型能够以很高的统计学准确性鉴别两个组别的血清肽差别。但是实验发现的多肽模型并没有进行盲选实验，实验结果还有待于证实，实验方法有待于改进。随着对蛋白质组的研究深入，新型蛋白质组学技术不断被开发出来，表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）就是其中的代表，相比于MALDI-TOF-MS，它可以直接使用未经处理的原始样本（比如血清、组织、体液等）进行检测,可以大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质，还可以以不同的方式的组合蛋白质谱,进行相关疾病的诊断与研究,目前在肿瘤的基础和临床中研究比较广泛。
　　1.2  表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）
　　SELDI-TOF-MS又称蛋白质指纹技术，由蛋白质芯片、飞行质谱和分析软件3部分组成。根据不同质荷比的蛋白质在仪器场中飞行的时间长短不一样，被测蛋白质群在图谱的位置取决于飞行时间并以峰的形式呈现，经计算机处理绘制形成质谱图，直接显示样品中各种蛋白质的分子量和含量。通过对实验组组与对照组的谱图进行比较，就能发现和捕获疾病的特异性相关蛋白质。
　　Yuxia Fan等[1]（2009）利用SELDI-TOF-MS分析并筛选出PTC患者和甲状腺良性病变患者三个差异血清蛋白质峰：触珠蛋白a1链（9190Da）、载脂蛋白C-I（6631Da）、载脂蛋白C-III（6631Da）。将触珠蛋白a1链高表达，载脂蛋白C-I和载脂蛋白C-III低表达建立为PTC诊断模型，其诊断敏感度为98％。特异性为97％。另进行盲选实验，测得PTC诊断的敏感度为95.15％，特异度为93.97％。Wang等[18](2006)和William H等[19]（2008）利用同样方法，建立由差异蛋白质峰构成肿瘤诊断模型。其PTC诊断敏感度和特异度均在80％以上甚至达到100％。SELDI-TOF-MS技术可以精确地分析并筛选出恶性肿瘤和良性肿瘤及正常血清之间的差异的蛋白质或多肽，能够发现它们之间细微的差别；同时血清采集、保存方便，数量足够。其可以用于肿瘤早期诊断，寻找肿瘤特异标志物。但是，这种方法没有目标蛋白，测量工程大，实验结果重复性差，还有待于进一步验证。
　　综上所述，以上实验中得到的差异蛋白相差甚远，敏感度和特异度也有不同程度的差异，这样的数据无法在临床应用。究其原因可以是：1，不同机构测量水平参差不齐，Alexander[20](2009)将20个高度提纯的重组人蛋白发到27个以液相色谱法为基础的蛋白质组学研究实验室，结果只有7个实验室正确报道出了20个蛋白。2，血清中的蛋白质或者多肽成分和数量处于动态变化之中，这种实验结果重复性差。无目标的检测血清中蛋白质差异这种方法似乎行不通。
　　2、分化型甲状腺癌蛋白质糖基化修饰异常研究
　　实际上，肿瘤的蛋白质组学研究主要包括2个方面①表达蛋白质组学（expression proteomics），侧重从数量和质荷比不同筛选差异蛋白质，建立肿瘤诊断模型。②功能蛋白质组学（functional proteomics），侧重在蛋白质结构、功能和作用机制水平上研究肿瘤发生和发展。所以蛋白质差异在不仅源于丰度表达差异，还反应在蛋白质合成后的修饰，包括磷酸化、糖基化、乙酰化[21]等。其中糖基化修饰是蛋白质最重要的翻译后修饰方式之一，也是科研中研究最多的。
　　蛋白质糖基化是寡糖片段和氨基酸的侧链共价连接在一起，随后具有一定氨基酸排列顺序的多肽链进一步折叠形成一定空间结构的蛋白质分子，是蛋白质翻译后重要的修饰之一，真核细胞中有2/3的蛋白质是糖基化修饰的。蛋白质的糖基化类型主要有两种：一种是N-糖基化，即寡糖片段共价连在含有天冬酰胺（Asn）的侧链上，N-糖基化普遍发生在细胞外环境的蛋白质中, 包括膜蛋白、分泌蛋白和体液中蛋白；另一种为O-糖基化，即寡糖片段连在含有丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的侧链上[22]。
　　蛋白质糖基化参与调节细胞许多生理和病理事件，比如细胞生长，迁徙，分化和肿瘤转移等。细胞膜表面糖蛋白位于细胞最外层，沟通着细胞内外环境，参与了受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程[23]。真核细胞中有2/3的蛋白质是糖基化修饰的，细胞表面很多受体属于糖蛋白，如EGFR、整合素和TGFBR都属N-糖基化修饰[21]。
　　Arcinas[24]在2009年比较分析了5个不同的人类甲状腺癌细胞系细胞表面蛋白和分泌蛋白的表达谱，一共鉴定出333个糖基化修饰蛋白。在对分化型甲状腺癌细胞系（TPC-1，FTC-133）的研究中，细胞膜蛋白、肉毒素、细胞粘附分子-1、滋养层细胞糖蛋白和盘状整合素α-5 蛋白链这五种蛋白只表达于DTC中。Miyoshi等[21]（2010）更进一步证实在分化型甲状腺癌的糖基化修饰肿瘤细胞中，糖基化修饰转移酶FUT8在早期明显上调，GnT-V在后期表达中明显上调。
　　从上述研究中可以看出，甲状腺组织细胞蛋白存在糖基化修饰增强。目前研究还发现在肝细胞癌（N-乙酰葡糖胺基转移酶V，GnT-V；N-乙酰葡糖胺基转移酶III，GnT-III；α1-6墨角藻糖基转移酶,α1-6FT）[25]、乳腺癌（N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V ，GnT-V）[26]和前列腺癌（B-结合珠蛋白）[27]患者的血清中存在蛋白糖基化修饰异常。Hidenori[28]在甲状腺癌患者血清中检测到Galectin-3的表达。目前分化型甲状腺癌血清蛋白糖基化修饰在早期诊断研究较少，但这种方法还是展现一定的发展前景，提供了新颖的研究思路，比如可以筛选几种DTC差异糖基化蛋白并结合特异性较强的甲状腺球蛋白作为诊断模型，所以分化型甲状腺癌蛋白质糖基化修饰异常研究还需要进一步研究。
　　结论和展望
　　综上所述，分化型甲状腺癌血清学早期诊断研究尚处于实验阶段。无目标血清蛋白质组学研究提供了很清晰的研究思路，但是血清蛋白质组学至今还没有应用于分化型甲状腺癌的临床早期诊断，究其原因有以下几点：1，仔细分析上述血清学检测结果，可以看出不同研究机构所得差异蛋白相差甚远，实验数据重复性差，无法临床应用[20]。2,血清蛋白质的99％是由22种高分子量蛋白组成，比如：白蛋白，转铁蛋白，结合球蛋白等；剩余的1％才是由数百种低分子量蛋白质组成的。血清中蛋白质数量种类繁多，并且常处于动态变化之中[9]。目前传统的试图通过无目标的血清/血浆的低丰度小分子肽来寻找肿瘤标志物这种方法似乎行不通。3，一味地研究蛋白质数量的改变。正常组织和肿瘤组织因基因改变产生的差异都要反应到蛋白上，但蛋白的功能差异在不仅源于丰度表达差异，更多在蛋白质合成后的修饰，包括磷酸化、糖基化、乙酰化等。随之分化型甲状腺癌蛋白质修饰方面研究开始起步发展，尤其是分化型甲状腺癌特异性糖基化蛋白质的研究，上述研究中可以看出，甲状腺组织细胞蛋白存在糖基化修饰增强，但是甲状腺癌的血清/血浆蛋白糖基化修饰异常研究较少，还需更进一步开展。