PRL腺瘤的診斷既要垂體腺瘤影像學的依據又要實驗室分析，表明存在持續的高泌乳素血癥。正常男性和女性PRL水平分別低於25ug/l和20ug/l（常用的測定法，1ug/l相當於21.2mIU/l，WHO標準84/500）。然而，其他的測試法得到的PRL值相應地高或低，正常值範圍也應該根據使用特定的測試法進行調整。干擾多巴胺作用通常使得PRL中度升高，很少超過150ug/l。
總體來說，血清PRL水平和腫瘤大小正相關。PRL值介於正常值上限和100ug/l之間，其原因包括服用精神活性藥，雌激素或功能性（自發性），也可能是PRL微腺瘤引起。PRL水平高於150ug/l（高於正常值5倍）的大多數患者患有PRL腺瘤。大腺瘤通常其PRL水平高於250ug/l，在一些病例大於1000ug/l。而且，這些值不是絕對的，PRL腺瘤表現為PRL水平的波動性升高，也可能出現腫瘤大小和激素分泌的不相關性。因此，垂體大腺瘤患者PRL水平中度升高時，解釋應該慎重，因為高泌乳素血癥的原因是腫瘤壓迫垂體柄所致，而不是PRL腺瘤造成的。
PRL分泌的動態測試
建議幾項PRL分泌的動態測試作為評價高泌乳素血癥的診斷工具，包括TRH、左旋多巴、氨苯甲異喹、多潘立酮刺激試驗和胰島素誘導的低血糖。儘管上述幾項方法在特定的情況下有用，但現在被廣泛認可的，應該是通過分析基礎PRL值，垂體影像，和排外其他原因來證實PRL腺瘤的診斷。
垂體影像
證實PRL腺瘤的診斷不但需要持續高泌乳素血癥的實驗室依據，而且需要垂體腺瘤的影像學依據。在排外諸如懷孕等引起高泌乳素血癥的潛在繼發性原因之後，應該完成增強的MRI掃描。在診斷小腺瘤和明確大腺瘤擴展範圍時，通過靜脈對比增強的CT掃描略差於MRI，但在無MRI或MRI有禁忌症的時候使用增強CT掃描。應該注意到有10％的正常人群患有微腺瘤。沒必要對正常人群行常規的MRI掃描用以排外微腺瘤。腫瘤鄰近視交叉的大腺瘤患者應行視力視野檢查（如computerized Goldman perimetry），但微腺瘤患者視力檢查不是必需的。
高泌乳素血癥同時有MRI發現的垂體腺瘤不總是明確提示PRL腺瘤的診斷，因為腫瘤壓迫垂體柄也能引起高泌乳素血癥。明確的診斷需要病理分析，然而PRL腺瘤很少需要外科手術切除。作為替代，通過藥物（多巴胺激動劑）治療幾個月連續評價血清PRL水平和腫瘤大小，從而獲得經驗性的診斷。一個療程治療後可能有三種結果：PRL正常加上腫瘤體積明顯縮小（75％或以上）證實PRL腺瘤的診斷；PRL正常，腫瘤體積未見改變或僅輕度縮小提示垂體腺瘤而不是PRL腺瘤；血清PRL和腫瘤體積均沒有改變表明是耐藥的PRL腺瘤。
