富含血小板的血浆如何用于足踝手术？

　　引言
　　血小板被人所熟知的功能是促进凝血。近几十年来随着医学基础科学的不断发展，现在我们知道血小板实际上具有多种生理功能。1978年，在探索动脉粥样硬化发病机理过程中，研究者们发现体外实验时，10％血清能显著促进平滑肌细胞的增殖，而换用贫血小板血清后，这种促细胞增殖效应消失了[1]。1978年，Witte首次发现血小板α颗粒里含有血小板源性生长因子 （platelet-derived growth factor, PDGF）。在之后的20年里，人们陆续发现血小板内含有类胰岛素生长因子（insulinlike growth factors, IGFs）, 转化生长因子-β（transforming growth factor β, TGF-β）, 血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor, VEGF）及成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor）。从90年代开始，随着转化医学在世界范围内兴起，富含高浓度血小板血浆（Platelet-rich Plasma, PRP）逐渐被应用于临床。PRP的分离制备过程简便，仅需在应用前对患者进行静脉穿刺取血离心后即可获得，几乎无创。由于是从自体血液中分离，所以在应用中不会产生免疫反应。1998年Marx医生首先将PRP在临床中用于下颌骨缺损修复，发现PRP显著缩短了成骨修复过程[2]。此后，PRP逐渐被用于整形外科领域，以促进骨融合，促进骨折修复，以及在急慢性肌腱损伤时加速软组织修复[3; 4]。最近PRP开始被应用于足踝外科领域。
　　PRP的定义及制备
　　PRP是源于自体血液的含高浓度血小板的血浆，它的成分包含了高浓度血小板、白细胞及纤维蛋白。血小板由骨髓产生，没有细胞核，但包含线粒体、微管、颗粒等结构。血小板内有两种分泌颗粒：致密颗粒及α颗粒。致密颗粒里含有二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5-羟色胺及钙离子；α颗粒中含有前述中的多种生长因子，它们能促进凝血，促进炎性细胞的迁移、骨髓间充质细胞的增殖及分化，血管再生以及细胞外基质形成。一般而言PRP中的血小板浓度可为正常血液中血小板浓度的3-17倍[5]。究竟PRP中血小板浓度是否越高越好现在仍无定论。Graziani认为PRP中最佳血小板浓度应为正常基线值的2.5倍。他认为大于该浓度会对血小板功能产生抑制。PRP中还含有多种高浓度的白细胞，包括淋巴细胞、单核细胞/巨嗜细胞及中性粒细胞[5]。它们能参与机体炎症反应，清除局部坏死组织及致病微生物，并受血小板分泌的生长因子调控，分泌相关蛋白参与组织修复。PRP中的纤维蛋白能为修复细胞提供三维支架，有利于各种生长因子及干细胞附着聚集。凝血酶、氯化钙及血管内皮损伤后胶原蛋白暴露均可激活血小板，导致血小板脱颗粒后快速释放出生长因子，并与纤维蛋白支架结合成网状结构，迅速在损伤部位形成胶状保护膜，理论上将进一步加速组织愈合。然而，由于大部分生长因子的半衰期较短，因此需要避免过早激活血小板。市售PRP制备套装一般都不会预激活血小板。通常加入枸橼酸钠，在抗凝的同时与钙离子结合，维持PRP中血小板处于生物学相对稳定状态。一旦将PRP应用于组织创面，暴露的胶原蛋白将自然激活血小板，释放生长因子并产生炎性反应持续3天左右[6]。间充质干细胞及成纤维细胞在损伤部位聚集参与组织增殖修复过程持续约数周之久，然后进入结构重塑过程持续约6月[7]。
　　PRP的制备目前尚缺乏统一规范，一般而言均采用2次离心法来选择性分离自体血液中的不同成分。根据血液离心过程中沉降率不同，第1次离心将含有血小板的血浆与红细胞分离；第2次离心将血小板和贫血小板血浆分离。目前国外有数十家公司的血小板分离制备系统上市，国内也已经有了掌握成熟技术的专业公司生产PRP制备套装，价格相对较为低廉，PRP中血小板浓度计活性均较佳[8]。
　　临床应用
　　PRP治疗技术在国外已经广泛应用于矫形外科领域，在国内尚属新兴技术。虽然有许多临床及基础研究报道PRP能促进骨骼及软组织的愈合，但由于其在足踝外科的临床应用资料有限，其在该领域的临床疗效仍有争议。
　　骨不连 (nonunion)
　　根据Ranly的研究报告，PRP主要的作用为促进成骨，而不能促进骨传导[9]。Gandhi首先对9名足踝骨折手术后并发骨不连的患者应用PRP治疗。这些患者都在骨折后20天内接受首次手术治疗，在术后的4至10月内诊断为骨不连。二次翻修手术时，作者在骨不连处联合应用PRP及自体骨移植，结果显示在翻修术后所有骨不连均愈合，平均愈合时间为60天。作者还比较了骨不连及骨愈合患者骨折部位血肿内的生长因子浓度，发现骨不连血肿中的PDGF及TGF-β浓度均较新鲜骨折明显降低。该研究提示在骨不连部位应用PRP，以及血小板激活后释放的生长因子可能对促进骨愈合起关键作用[10]。
　　在Bibbo进行的临床前瞻性研究中，62名具有骨不连高危因素的足踝择期手术患者在接受PRP治疗后随访6个月。这些患者分别接受了足踝不同部位的手术。其中一部分患者根据病情需要同时接受了PRP治疗和自体骨移植。术后每两周照X光片评估PRP疗效，发现有94％的患者在术后平均41天左右达到骨愈合。单纯接受PRP治疗的患者平均骨愈合时间为40天，而接受联合治疗的患者平均骨愈合时间为45天[11]。作者认为PRP对于治疗骨不连高危患者具有重要作用，然而此项研究存在局限性，其一是这些患者的足踝疾患及接受的手术方法各不相同。其二是该项研究缺乏未接受PRP治疗的对照组。
　　接受Depuy公司第三代Agility全踝关节假体置换术后的患者，在完全负重行走之前，需要评估下胫腓联合的融合情况。Coetzee比较了在踝关节置换时应用或不应用PRP治疗对下胫腓联合融合率的影响[12]。术中胫骨远端及距骨截骨后，在下胫腓联合处、胫距截骨面及关节假体表面均用PRP喷涂。在下胫腓关节联合应用PRP及自体骨移植。术后定期复查X光片。若骨融合可疑时，给予复查CT。结果显示应用PRP组较之既往112名未接受PRP治疗对照组患者，在术后8周及12周时，下胫腓联合融合改善率分别为61.4％及73.6％；在联合应用PRP及自体骨移植组较对照组患者，融合改善率分别为76％及93.9％。PRP同时显著降低了术后6月时骨融合部位愈合不良或骨不连发生率。
　　软骨病变
　　足踝在人直立负重行走时承受压力巨大，也是最易出现软骨损伤，进而发生骨性关节炎的部位之一。由于关节软骨内没有血管及神经，一旦损伤后自身缺乏修复能力[13]。PRP中所含的TGF-β及PDGF已被基础研究证实可以抑制参与软骨破坏炎性反应的白介素1β及肿瘤坏死因子α活性，从而在软骨损伤时抑制炎性反应[14-16]。此外，PRP还能促进软骨细胞中蛋白多糖及胶原的合成，能直接促进软骨细胞生长及成软骨细胞向软骨细胞定向分化，促进软骨损伤修复[17; 18]。
　　Mei-Dan在一项前瞻性研究中比较了分别应用透明质酸及PRP踝关节腔内注射治疗距骨软骨损伤的临床效果[19]。作者将患者分为两组，于每周分别注射一次透明质酸或PRP，连续注射三周后，在28周内对两组患者进行随访，分别评估患者踝关节疼痛、僵硬程度及运动功能改善情况。研究结果发现PRP治疗组踝关节疼痛及功能恢复显著优于透明质酸组。
　　Giannini和他的同事们研究了术中应用PRP治疗距骨软骨损伤的价值[20]。在该项研究中，他们描述了一种创新的技术：用传统骨穿针从患者的后侧髂嵴穿刺抽吸60ml骨髓细胞，将这些骨髓细胞进一步离心后获得6ml浓缩间充值干细胞（MSC）。用踝关节镜显露距骨软骨病变后，先用与软骨创面大小一致的透明质酸膜作为支架覆于创面，再将2ml浓缩MSC与1ml PRP胶混匀后，涂于透明质酸支架表面。研究中包括了81名患者，有25人接受了这种PRP+MSC+透明质酸支架治疗；46人接受了关节镜下软骨细胞移植；10人接受了开放性手术软骨细胞移植。术后随访最长为3年。临床评估包括了美国足踝外科协会（AOFAS）评分及影像学分析。结果表明三种不同治疗方法均获得了显著临床疗效，组间比较无显著差异。X片未发现术后出现骨性关节炎，MRI提示距骨软骨病变区域充填率较高，周围组织有新生软骨出现。他们的研究提示了应用PRP可能促进MSC向软骨细胞定向分化，对修复软骨损伤具有重要作用。
　　跟腱病变
　　跟腱是人体最容易受到运动损伤的部位之一，近年来PRP在跟腱病变的临床应用也最为广泛。PRP被用于治疗急性跟腱断裂及慢性跟腱炎。2007年，Sanchez首先报道了应用PRP治疗跟腱完全断裂的运动员[21]。在这项病例对照研究中，6名患者接受了跟腱断裂切开修补术。在缝合腱旁组织之前，在肌腱断裂修补部位注射4ml已经激活的PRP，随后将一种纤维蛋白支架放置于修补部位表面。他将另外6名年龄性别及损伤机制相仿的跟腱完全断裂既往接受单纯手术治疗的患者设为对照组。术后随访评估了踝关节完全恢复活动的时间、患者恢复低强度跑步的时间及恢复正常运动训练的时间。研究结果发现术中接受PRP注射的患者没有出现伤口并发症，在术后早期即恢复了踝关节正常活动范围，术后恢复低强度跑步及正常运动训练所需时间均较回顾性对照组有显著缩短。
　　然而，Schepull进行的一项随机对照临床研究却对PRP治疗跟腱断裂得出了相反的结论[22]。在他的研究中，他把30名介于18岁至60岁之间的跟腱断裂患者随机分为两组：一组接受单纯跟腱修补术；另一组在术中跟腱修补部位注射10ml PRP。在术后的52周随访期里，通过CT影像分析两组患者跟腱的生物力学指标，包括弹性模量(elastic modulus)及单位面积应力(strain per unit)；通过提踵指数（heel raise index）及跟腱断裂评分（Achilles Tendon Rupture Score, ATRS）评估临床功能。研究发现接受PRP治疗组与单纯手术对照组在术后各项生物力学指标及临床功能指标方面均无显著性差异。研究结论并不支持临床应用PRP治疗跟腱断裂。
　　在一项双盲随机对照临床研究中，de Vos 评估了PRP在治疗慢性跟腱炎方面的应用价值[23; 24]。该研究中纳入54名患者，年龄从18岁至70岁之间（平均年龄49.5岁）。基于跟腱增厚及活动后疼痛超过2月确定诊断。跟腱病变位于跟骨止点上方2至7cm处。排除标准包括并发其它骨骼肌肉损伤（肌腱断裂，止点性疾患），应用可能致跟腱病变药物（喹诺酮类），既往应用PRP治疗及曾经进行过高强度运动。患者被随机分为治疗组及对照组。治疗组患者由医师在超声引导性，在跟腱病变附近的3个穿刺点注入4ml PRP; 对照组患者接受相应生理盐水注射。注射治疗1周后，所有患者接受为期1周的跟腱拉伸锻炼及12周的离心锻炼（eccentric exercise）。于治疗后第6、12及24周分别评估疗效，结果发表于2份杂志。在第一份报告里，作者选用的首要评估指标为维多利亚运动学院跟腱评分问卷（Victorian Institute of Sports Assessment-Achilles, VISA-A），用它量化评估疼痛及活动水平；另外指标包括患者主观满意度、返回运动率及坚持锻炼率。该份报告显示24周时治疗组和对照组VISA-A评分分别为21.7及20.5；返回运动率分别为78％和67％，但结果均无统计学差异[23]。在第二份报告中，作者发现注射1年后，两组患者在临床指标及返回运动率方面均无统计学差异，超声影像评估发现两组患者跟腱厚度降低，跟腱内新生血管数量减少及肌腱组织结构改善。两组间无显著性差异[24]。
　　Gaweda进行了一项应用PRP治疗慢性非止点性跟腱炎的前瞻性研究[25]。研究纳入14名非止点性跟腱炎患者。这些患者均接受超声引导下病变部位3ml PRP注射治疗。注射后两周内进行踝关节被动锻炼，2周后进行包括提踵在内的主动锻炼。于治疗后第1.5、3、6及18月后应用AOFAS后足评分、VISA-A及超声影像评估疗效。治疗后18月，患者AOFAS后足评分及VISA-A评分均较治疗前有显著改善。超声影像随访也发现治疗后肌腱结构明显改善；腱周组织形态恢复正常；跟腱血流在治疗后最初3月显著增加后逐渐减少。作者结论是PRP治疗可以显著改善非止点性跟腱炎患者临床症状，有利于跟腱组织恢复正常结构。
　　Delos在另一项研究中探讨了PRP应用于32名经过6周保守治疗无效的跟腱炎患者的疗效[26]。在1年的随访期内，25名患者（78％）经PRP治疗后临床症状完全消失；其余7名患者（22％）经治疗后症状无改善或加剧。
　　跖腱膜炎
　　跖腱膜炎是引起跟痛症的最常见原因，临床上通常采用非手术治疗，包括改变日常活动习惯，应用足垫，拉伸锻炼，应用非甾体抗炎药及局部注射内固醇激素。目前普遍认为跖腱膜炎是一种退行性病变而非单纯的炎性进程。手术中切下的跖腱膜病变组织形态呈退行性改变，伴有慢性炎性反应及成纤维细胞增生[27]。PRP内含有的多种生长因子可能抑制跖腱膜退变过程。
　　在最近一项双盲临床队列研究中，AKsahin对比了应用PRP及类固醇激素治疗跖腱膜炎的疗效[28]。他将60名患者分为两组：PRP组接受病变部位单次3ml PRP注射；激素组接受单次3ml 皮质类固醇激素注射。随访6月后，两组患者症状及功能较治疗前均有显著改善，而两组间比较无显著性差异。作者认为，PRP对跖腱膜炎有较好治疗效果，应作为首选治疗方法应用于临床。虽然PRP疗效与类固醇激素相比无显著差异，但至少可避免激素治疗的潜在风险。
　　Ragab和Othman在最近一项研究中，对25名慢性跖腱膜炎患者进行病变部位单次注射5ml PRP治疗[29]。在平均10月随访期内评估疼痛及足部功能情况。结果发现超过90％的患者对治疗效果非常满意，足部功能完全康复，能在PRP注射2周后恢复日常活动。超声影像检查发现病变跖腱膜厚度治疗后较治疗前明显减少。作者认为PRP可促进跖腱膜再生修复，是一种安全有效的治疗方法。
　　糖尿病足
　　糖尿病患者合并足部疾患，临床上常常治疗困难。此类患者易于出现骨不连或骨关节融合手术失败，易并发感染，皮肤溃疡难以愈合。基础研究表明糖尿病足损伤部位及外科手术部位的多种关键生长因子浓度均显著降低[30; 31]。近年发现，接受Charcot关节重建手术失败的糖尿病患者，骨关节融合部位组织内的PDGF和VEGF水平均较正常人明显降低[32]。PRP中含有多种生长因子，临床上已有Charcot关节重建手术中辅助应用PRP治疗的相关报道。
　　在2012年一项临床前瞻性研究中，Pinzur应用PRP辅助足部手术治疗Charcot关节病变[33]。共有44名接受足部骨关节融合手术的高危糖尿病患者（包括46只足）参与此项研究。患者平均年龄为54.9岁，平均身高体重指数（BMI）为38.0。男性24名，女性20名。其中28人足部合并开放性伤口及骨髓炎。矫形术后均用环形外固定架固定。在缝合伤口时，所有患者均接受自体PRP及骨髓吸取物注射。术后有42只足在平均26.2月时出现骨愈合。有两名患者由于持续足部感染而截肢。作者认为PRP联合应用少量骨髓抽吸物辅助治疗高危糖尿病患者Charcot关节病变时，在骨关节融合手术中的疗效能媲美自体骨移植。
　　在一项多中心前瞻性临床随机对照研究中，Driver等人应用自体PRP胶治疗糖尿病足部溃疡。共有40名符合条件的患者被纳入研究。他们被随机分为两组：治疗组（19人）接受PRP胶局部治疗；对照组（21人）接受生理盐水胶治疗。每2周评估一次溃疡愈合情况，共持续12周。治疗组及对照组分别有13（68.4％）及9人（42.9％）溃疡痊愈。Kaplan-Meier 愈合时间分析亦显示PRP治疗组显著优于对照组。PRP治疗中未出现严重副反应。研究结论是在糖尿病足部溃疡应用PRP疗效显著。
　　讨论
　　PRP在足踝外科领域的应用方兴未艾，目前已经用于治疗包括骨折、骨关节融合、骨关节炎、跟腱病变、慢性跖腱膜炎及糖尿病足等多种足踝外科疾患，其临床应用指征还有不断扩大趋势。然而我们必须知道，现阶段尚未能清晰制定出PRP治疗的绝对适应症。到底将其作为一种保守治疗手段还是作为足踝外科手术中的辅助治疗手段尚无定论。关于PRP的制备方法，包括血液分离方法及相关参数，在国内外各公司所提供的用于制备PRP的商业套装设备中缺乏统一标准。
　　分离后PRP中血小板的最佳浓度尚有待确定。有研究表明，血小板及其中所含生长因子浓度与其对病变组织的促修复作用可能并非线性关系。损伤部位细胞表面与生长因子结合的受体位点可能会“饱和”。一旦生长因子的数量超过了细胞表面相应受体的数量，组织中多余的游离生长因子甚至可能抑制细胞活性，从而影响PRP的临床治疗效果[34]。此外，既往研究表明，在拥有相似血小板浓度的正常人，不同人体内的生长因子浓度也不一样。这种差异可能影响到PRP针对某种特定疾患的临床治疗效果，并可能由此影响研究过程中数据分析的准确性。
　　白细胞及单核细胞可存在于分离后的PRP中。它们在炎症反应早期的作用已经广为人知。一些研究者认为PRP中的白细胞能清除局部坏死组织及致病微生物，但也有研究者认为在炎性反应中应用PRP时，白细胞介导产生的蛋白酶及氧自由基可能对组织修复有害[35]；在损伤组织里，随着白细胞浓度增高，一些参与组织分解代谢的基因表达显著增强[36]；基于现阶段的研究报告，是否在分离PRP时包含白细胞仍然不明确。
　　现在国内外在足踝外科临床应用PRP时仍然缺乏达成普遍共识的治疗指南。特别当用于非手术治疗某种特定疾病时，每次注射PRP的剂量，共需要注射的次数及每次注射的间隔时间尚无统一要求。
　　PRP在足踝外科需注意避免用于合并以下情况的患者：血小板减少症、血流动力学不稳、败血症及植骨区感染。从这些患者抽血分离应用PRP时可能加重出血；加重休克及导致感染扩散。对于合并骨肿瘤的患者，应用PRP时亦需谨慎。PRP中所含的多种生长因子有促进肿瘤增值生长的风险。此外，高浓度PRP关节腔内注射可能会引起关节疼痛及一过性的关节功能障碍，在应用PRP治疗前需要与患者进行充分沟通，取得患者的完全信任及合作。
　　PRP应用于足踝外科在国内外均刚刚起步不久，在临床上已经展现出令人振奋的应用前景。大多数患者对PRP治疗效果感到满意。然而已发表的相关临床研究文章数量仍十分有限，而且这些文献中相当一部分都是经验回顾性报道，将来尚需要进行设计严密的高质量大样本随机对照研究以进一步证实PRP的应用价值，有针对性的制定出我国PRP自体血液分离标准及足踝外科临床应用指南，以更好服务于患者。