因臨床表現複雜、多樣化，且嬰兒常突發重症，故必須儘早確診及時搶救。根據餵養史、乳母膳食史、臨床表現，以及結合流行病史，可作出診斷。
疑有本病者，應立即給予維生素B1試驗性治療。本病在治療後迅速好轉，可作為確診的有力依據。測定血中維生素B1濃度可明確診斷，但由於測定技術複雜，臨床不易推廣。亦可採用維生素B1負荷試驗，若尿中維生素B1排出量減少，可協助診斷。
此外，檢測全血丙酮酸和乳酸含量明顯增高、紅細胞轉酮酶活性降低，均有助於診斷。
診斷上應注意與有類似症狀的疾病相鑑別，如有嗆咳、氣急時與吸入性肺炎;初發症狀有嘔吐時與肥厚性幽門狹窄;腦型腳氣病與中樞神經系統感染如腦炎、腦膜炎等;心臟型腳氣病與引起急性心力衰竭的各種疾病如心內膜彈力纖維增生症、先天性心臟病等;周圍性神經炎與多發性神經根炎、脊髓灰質炎等疾病相鑑別。
若臨床上符合維生素B1缺乏症，經維生素B1治療後好轉，但停藥後復發，應考慮遺傳性丙酮酸羧化酶缺陷所致的維生素B1依賴症。
