富含血小板的血漿如何用於足踝手術？

　　引言
　　血小板被人所熟知的功能是促進凝血。近幾十年來隨著醫學基礎科學的不斷髮展，現在我們知道血小板實際上具有多種生理功能。1978年，在探索動脈粥樣硬化發病機理過程中，研究者們發現體外實驗時，10％血清能顯著促進平滑肌細胞的增殖，而換用貧血小板血清後，這種促細胞增殖效應消失了[1]。1978年，Witte首次發現血小板α顆粒裡含有血小板源性生長因子 （platelet-derived growth factor, PDGF）。在之後的20年裡，人們陸續發現血小板內含有類胰島素生長因子（insulinlike growth factors, IGFs）, 轉化生長因子-β（transforming growth factor β, TGF-β）, 血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor, VEGF）及成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor）。從90年代開始，隨著轉化醫學在世界範圍內興起，富含高濃度血小板血漿（Platelet-rich Plasma, PRP）逐漸被應用於臨床。PRP的分離製備過程簡便，僅需在應用前對患者進行靜脈穿刺取血離心後即可獲得，幾乎無創。由於是從自體血液中分離，所以在應用中不會產生免疫反應。1998年Marx醫生首先將PRP在臨床中用於下頜骨缺損修復，發現PRP顯著縮短了成骨修復過程[2]。此後，PRP逐漸被用於整形外科領域，以促進骨融合，促進骨折修復，以及在急慢性肌腱損傷時加速軟組織修復[3; 4]。最近PRP開始被應用於足踝外科領域。
　　PRP的定義及製備
　　PRP是源於自體血液的含高濃度血小板的血漿，它的成分包含了高濃度血小板、白細胞及纖維蛋白。血小板由骨髓產生，沒有細胞核，但包含線粒體、微管、顆粒等結構。血小板內有兩種分泌顆粒：緻密顆粒及α顆粒。緻密顆粒裡含有二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5-羥色胺及鈣離子；α顆粒中含有前述中的多種生長因子，它們能促進凝血，促進炎性細胞的遷移、骨髓間充質細胞的增殖及分化，血管再生以及細胞外基質形成。一般而言PRP中的血小板濃度可為正常血液中血小板濃度的3-17倍[5]。究竟PRP中血小板濃度是否越高越好現在仍無定論。Graziani認為PRP中最佳血小板濃度應為正常基線值的2.5倍。他認為大於該濃度會對血小板功能產生抑制。PRP中還含有多種高濃度的白細胞，包括淋巴細胞、單核細胞/巨嗜細胞及中性粒細胞[5]。它們能參與機體炎症反應，清除局部壞死組織及致病微生物，並受血小板分泌的生長因子調控，分泌相關蛋白參與組織修復。PRP中的纖維蛋白能為修復細胞提供三維支架，有利於各種生長因子及幹細胞附著聚集。凝血酶、氯化鈣及血管內皮損傷後膠原蛋白暴露均可激活血小板，導致血小板脫顆粒後快速釋放出生長因子，並與纖維蛋白支架結合成網狀結構，迅速在損傷部位形成膠狀保護膜，理論上將進一步加速組織癒合。然而，由於大部分生長因子的半衰期較短，因此需要避免過早激活血小板。市售PRP製備套裝一般都不會預激活血小板。通常加入枸櫞酸鈉，在抗凝的同時與鈣離子結合，維持PRP中血小板處於生物學相對穩定狀態。一旦將PRP應用於組織創面，暴露的膠原蛋白將自然激活血小板，釋放生長因子併產生炎性反應持續3天左右[6]。間充質幹細胞及成纖維細胞在損傷部位聚集參與組織增殖修復過程持續約數週之久，然後進入結構重塑過程持續約6月[7]。
　　PRP的製備目前尚缺乏統一規範，一般而言均採用2次離心法來選擇性分離自體血液中的不同成分。根據血液離心過程中沉降率不同，第1次離心將含有血小板的血漿與紅細胞分離；第2次離心將血小板和貧血小板血漿分離。目前國外有數十家公司的血小板分離製備系統上市，國內也已經有了掌握成熟技術的專業公司生產PRP製備套裝，價格相對較為低廉，PRP中血小板濃度計活性均較佳[8]。
　　臨床應用
　　PRP治療技術在國外已經廣泛應用於矯形外科領域，在國內尚屬新興技術。雖然有許多臨床及基礎研究報道PRP能促進骨骼及軟組織的癒合，但由於其在足踝外科的臨床應用資料有限，其在該領域的臨床療效仍有爭議。
　　骨不連 (nonunion)
　　根據Ranly的研究報告，PRP主要的作用為促進成骨，而不能促進骨傳導[9]。Gandhi首先對9名足踝骨折手術後併發骨不連的患者應用PRP治療。這些患者都在骨折後20天內接受首次手術治療，在術後的4至10月內診斷為骨不連。二次翻修手術時，作者在骨不連處聯合應用PRP及自體骨移植，結果顯示在翻修術後所有骨不連均癒合，平均癒合時間為60天。作者還比較了骨不連及骨癒合患者骨折部位血腫內的生長因子濃度，發現骨不連血腫中的PDGF及TGF-β濃度均較新鮮骨折明顯降低。該研究提示在骨不連部位應用PRP，以及血小板激活後釋放的生長因子可能對促進骨癒合起關鍵作用[10]。
　　在Bibbo進行的臨床前瞻性研究中，62名具有骨不連高危因素的足踝擇期手術患者在接受PRP治療後隨訪6個月。這些患者分別接受了足踝不同部位的手術。其中一部分患者根據病情需要同時接受了PRP治療和自體骨移植。術後每兩週照X光片評估PRP療效，發現有94％的患者在術後平均41天左右達到骨癒合。單純接受PRP治療的患者平均骨癒合時間為40天，而接受聯合治療的患者平均骨癒合時間為45天[11]。作者認為PRP對於治療骨不連高危患者具有重要作用，然而此項研究存在侷限性，其一是這些患者的足踝疾患及接受的手術方法各不相同。其二是該項研究缺乏未接受PRP治療的對照組。
　　接受Depuy公司第三代Agility全踝關節假體置換術後的患者，在完全負重行走之前，需要評估下脛腓聯合的融合情況。Coetzee比較了在踝關節置換時應用或不應用PRP治療對下脛腓聯合融合率的影響[12]。術中脛骨遠端及距骨截骨後，在下脛腓聯合處、脛距截骨面及關節假體表面均用PRP噴塗。在下脛腓關節聯合應用PRP及自體骨移植。術後定期複查X光片。若骨融合可疑時，給予複查CT。結果顯示應用PRP組較之既往112名未接受PRP治療對照組患者，在術後8周及12周時，下脛腓聯合融合改善率分別為61.4％及73.6％；在聯合應用PRP及自體骨移植組較對照組患者，融合改善率分別為76％及93.9％。PRP同時顯著降低了術後6月時骨融合部位癒合不良或骨不連發生率。
　　軟骨病變
　　足踝在人直立負重行走時承受壓力巨大，也是最易出現軟骨損傷，進而發生骨性關節炎的部位之一。由於關節軟骨內沒有血管及神經，一旦損傷後自身缺乏修復能力[13]。PRP中所含的TGF-β及PDGF已被基礎研究證實可以抑制參與軟骨破壞炎性反應的白介素1β及腫瘤壞死因子α活性，從而在軟骨損傷時抑制炎性反應[14-16]。此外，PRP還能促進軟骨細胞中蛋白多糖及膠原的合成，能直接促進軟骨細胞生長及成軟骨細胞向軟骨細胞定向分化，促進軟骨損傷修復[17; 18]。
　　Mei-Dan在一項前瞻性研究中比較了分別應用透明質酸及PRP踝關節腔內注射治療距骨軟骨損傷的臨床效果[19]。作者將患者分為兩組，於每週分別注射一次透明質酸或PRP，連續注射三週後，在28周內對兩組患者進行隨訪，分別評估患者踝關節疼痛、僵硬程度及運動功能改善情況。研究結果發現PRP治療組踝關節疼痛及功能恢復顯著優於透明質酸組。
　　Giannini和他的同事們研究了術中應用PRP治療距骨軟骨損傷的價值[20]。在該項研究中，他們描述了一種創新的技術：用傳統骨穿針從患者的後側髂嵴穿刺抽吸60ml骨髓細胞，將這些骨髓細胞進一步離心後獲得6ml濃縮間充值幹細胞（MSC）。用踝關節鏡顯露距骨軟骨病變後，先用與軟骨創面大小一致的透明質酸膜作為支架覆於創面，再將2ml濃縮MSC與1ml PRP膠混勻後，塗於透明質酸支架表面。研究中包括了81名患者，有25人接受了這種PRP+MSC+透明質酸支架治療；46人接受了關節鏡下軟骨細胞移植；10人接受了開放性手術軟骨細胞移植。術後隨訪最長為3年。臨床評估包括了美國足踝外科協會（AOFAS）評分及影像學分析。結果表明三種不同治療方法均獲得了顯著臨床療效，組間比較無顯著差異。X片未發現術後出現骨性關節炎，MRI提示距骨軟骨病變區域充填率較高，周圍組織有新生軟骨出現。他們的研究提示了應用PRP可能促進MSC向軟骨細胞定向分化，對修復軟骨損傷具有重要作用。
　　跟腱病變
　　跟腱是人體最容易受到運動損傷的部位之一，近年來PRP在跟腱病變的臨床應用也最為廣泛。PRP被用於治療急性跟腱斷裂及慢性跟腱炎。2007年，Sanchez首先報道了應用PRP治療跟腱完全斷裂的運動員[21]。在這項病例對照研究中，6名患者接受了跟腱斷裂切開修補術。在縫合腱旁組織之前，在肌腱斷裂修補部位注射4ml已經激活的PRP，隨後將一種纖維蛋白支架放置於修補部位表面。他將另外6名年齡性別及損傷機制相仿的跟腱完全斷裂既往接受單純手術治療的患者設為對照組。術後隨訪評估了踝關節完全恢復活動的時間、患者恢復低強度跑步的時間及恢復正常運動訓練的時間。研究結果發現術中接受PRP注射的患者沒有出現傷口併發症，在術後早期即恢復了踝關節正常活動範圍，術後恢復低強度跑步及正常運動訓練所需時間均較回顧性對照組有顯著縮短。
　　然而，Schepull進行的一項隨機對照臨床研究卻對PRP治療跟腱斷裂得出了相反的結論[22]。在他的研究中，他把30名介於18歲至60歲之間的跟腱斷裂患者隨機分為兩組：一組接受單純跟腱修補術；另一組在術中跟腱修補部位注射10ml PRP。在術後的52周隨訪期裡，通過CT影像分析兩組患者跟腱的生物力學指標，包括彈性模量(elastic modulus)及單位面積應力(strain per unit)；通過提踵指數（heel raise index）及跟腱斷裂評分（Achilles Tendon Rupture Score, ATRS）評估臨床功能。研究發現接受PRP治療組與單純手術對照組在術後各項生物力學指標及臨床功能指標方面均無顯著性差異。研究結論並不支持臨床應用PRP治療跟腱斷裂。
　　在一項雙盲隨機對照臨床研究中，de Vos 評估了PRP在治療慢性跟腱炎方面的應用價值[23; 24]。該研究中納入54名患者，年齡從18歲至70歲之間（平均年齡49.5歲）。基於跟腱增厚及活動後疼痛超過2月確定診斷。跟腱病變位於跟骨止點上方2至7cm處。排除標準包括併發其它骨骼肌肉損傷（肌腱斷裂，止點性疾患），應用可能致跟腱病變藥物（喹諾酮類），既往應用PRP治療及曾經進行過高強度運動。患者被隨機分為治療組及對照組。治療組患者由醫師在超聲引導性，在跟腱病變附近的3個穿刺點注入4ml PRP; 對照組患者接受相應生理鹽水注射。注射治療1周後，所有患者接受為期1周的跟腱拉伸鍛鍊及12周的離心鍛鍊（eccentric exercise）。於治療後第6、12及24周分別評估療效，結果發表於2份雜誌。在第一份報告裡，作者選用的首要評估指標為維多利亞運動學院跟腱評分問卷（Victorian Institute of Sports Assessment-Achilles, VISA-A），用它量化評估疼痛及活動水平；另外指標包括患者主觀滿意度、返回運動率及堅持鍛鍊率。該份報告顯示24周時治療組和對照組VISA-A評分分別為21.7及20.5；返回運動率分別為78％和67％，但結果均無統計學差異[23]。在第二份報告中，作者發現注射1年後，兩組患者在臨床指標及返回運動率方面均無統計學差異，超聲影像評估發現兩組患者跟腱厚度降低，跟腱內新生血管數量減少及肌腱組織結構改善。兩組間無顯著性差異[24]。
　　Gaweda進行了一項應用PRP治療慢性非止點性跟腱炎的前瞻性研究[25]。研究納入14名非止點性跟腱炎患者。這些患者均接受超聲引導下病變部位3ml PRP注射治療。注射後兩週內進行踝關節被動鍛鍊，2周後進行包括提踵在內的主動鍛鍊。於治療後第1.5、3、6及18月後應用AOFAS後足評分、VISA-A及超聲影像評估療效。治療後18月，患者AOFAS後足評分及VISA-A評分均較治療前有顯著改善。超聲影像隨訪也發現治療後肌腱結構明顯改善；腱周組織形態恢復正常；跟腱血流在治療後最初3月顯著增加後逐漸減少。作者結論是PRP治療可以顯著改善非止點性跟腱炎患者臨床症狀，有利於跟腱組織恢復正常結構。
　　Delos在另一項研究中探討了PRP應用於32名經過6周保守治療無效的跟腱炎患者的療效[26]。在1年的隨訪期內，25名患者（78％）經PRP治療後臨床症狀完全消失；其餘7名患者（22％）經治療後症狀無改善或加劇。
　　蹠腱膜炎
　　蹠腱膜炎是引起跟痛症的最常見原因，臨床上通常採用非手術治療，包括改變日常活動習慣，應用足墊，拉伸鍛鍊，應用非甾體抗炎藥及局部注射內固醇激素。目前普遍認為蹠腱膜炎是一種退行性病變而非單純的炎性進程。手術中切下的蹠腱膜病變組織形態呈退行性改變，伴有慢性炎性反應及成纖維細胞增生[27]。PRP內含有的多種生長因子可能抑制蹠腱膜退變過程。
　　在最近一項雙盲臨床隊列研究中，AKsahin對比了應用PRP及類固醇激素治療蹠腱膜炎的療效[28]。他將60名患者分為兩組：PRP組接受病變部位單次3ml PRP注射；激素組接受單次3ml 皮質類固醇激素注射。隨訪6月後，兩組患者症狀及功能較治療前均有顯著改善，而兩組間比較無顯著性差異。作者認為，PRP對蹠腱膜炎有較好治療效果，應作為首選治療方法應用於臨床。雖然PRP療效與類固醇激素相比無顯著差異，但至少可避免激素治療的潛在風險。
　　Ragab和Othman在最近一項研究中，對25名慢性蹠腱膜炎患者進行病變部位單次注射5ml PRP治療[29]。在平均10月隨訪期內評估疼痛及足部功能情況。結果發現超過90％的患者對治療效果非常滿意，足部功能完全康復，能在PRP注射2周後恢復日常活動。超聲影像檢查發現病變蹠腱膜厚度治療後較治療前明顯減少。作者認為PRP可促進蹠腱膜再生修復，是一種安全有效的治療方法。
　　糖尿病足
　　糖尿病患者合併足部疾患，臨床上常常治療困難。此類患者易於出現骨不連或骨關節融合手術失敗，易併發感染，皮膚潰瘍難以癒合。基礎研究表明糖尿病足損傷部位及外科手術部位的多種關鍵生長因子濃度均顯著降低[30; 31]。近年發現，接受Charcot關節重建手術失敗的糖尿病患者，骨關節融合部位組織內的PDGF和VEGF水平均較正常人明顯降低[32]。PRP中含有多種生長因子，臨床上已有Charcot關節重建手術中輔助應用PRP治療的相關報道。
　　在2012年一項臨床前瞻性研究中，Pinzur應用PRP輔助足部手術治療Charcot關節病變[33]。共有44名接受足部骨關節融合手術的高危糖尿病患者（包括46只足）參與此項研究。患者平均年齡為54.9歲，平均身高體重指數（BMI）為38.0。男性24名，女性20名。其中28人足部合併開放性傷口及骨髓炎。矯形術後均用環形外固定架固定。在縫合傷口時，所有患者均接受自體PRP及骨髓吸取物注射。術後有42只足在平均26.2月時出現骨癒合。有兩名患者由於持續足部感染而截肢。作者認為PRP聯合應用少量骨髓抽吸物輔助治療高危糖尿病患者Charcot關節病變時，在骨關節融合手術中的療效能媲美自體骨移植。
　　在一項多中心前瞻性臨床隨機對照研究中，Driver等人應用自體PRP膠治療糖尿病足部潰瘍。共有40名符合條件的患者被納入研究。他們被隨機分為兩組：治療組（19人）接受PRP膠局部治療；對照組（21人）接受生理鹽水膠治療。每2周評估一次潰瘍癒合情況，共持續12周。治療組及對照組分別有13（68.4％）及9人（42.9％）潰瘍痊癒。Kaplan-Meier 癒合時間分析亦顯示PRP治療組顯著優於對照組。PRP治療中未出現嚴重副反應。研究結論是在糖尿病足部潰瘍應用PRP療效顯著。
　　討論
　　PRP在足踝外科領域的應用方興未艾，目前已經用於治療包括骨折、骨關節融合、骨關節炎、跟腱病變、慢性蹠腱膜炎及糖尿病足等多種足踝外科疾患，其臨床應用指徵還有不斷擴大趨勢。然而我們必須知道，現階段尚未能清晰制定出PRP治療的絕對適應症。到底將其作為一種保守治療手段還是作為足踝外科手術中的輔助治療手段尚無定論。關於PRP的製備方法，包括血液分離方法及相關參數，在國內外各公司所提供的用於製備PRP的商業套裝設備中缺乏統一標準。
　　分離後PRP中血小板的最佳濃度尚有待確定。有研究表明，血小板及其中所含生長因子濃度與其對病變組織的促修復作用可能並非線性關係。損傷部位細胞表面與生長因子結合的受體位點可能會“飽和”。一旦生長因子的數量超過了細胞表面相應受體的數量，組織中多餘的遊離生長因子甚至可能抑制細胞活性，從而影響PRP的臨床治療效果[34]。此外，既往研究表明，在擁有相似血小板濃度的正常人，不同人體內的生長因子濃度也不一樣。這種差異可能影響到PRP針對某種特定疾患的臨床治療效果，並可能由此影響研究過程中數據分析的準確性。
　　白細胞及單核細胞可存在於分離後的PRP中。它們在炎症反應早期的作用已經廣為人知。一些研究者認為PRP中的白細胞能清除局部壞死組織及致病微生物，但也有研究者認為在炎性反應中應用PRP時，白細胞介導產生的蛋白酶及氧自由基可能對組織修復有害[35]；在損傷組織裡，隨著白細胞濃度增高，一些參與組織分解代謝的基因表達顯著增強[36]；基於現階段的研究報告，是否在分離PRP時包含白細胞仍然不明確。
　　現在國內外在足踝外科臨床應用PRP時仍然缺乏達成普遍共識的治療指南。特別當用於非手術治療某種特定疾病時，每次注射PRP的劑量，共需要注射的次數及每次注射的間隔時間尚無統一要求。
　　PRP在足踝外科需注意避免用於合併以下情況的患者：血小板減少症、血流動力學不穩、敗血症及植骨區感染。從這些患者抽血分離應用PRP時可能加重出血；加重休克及導致感染擴散。對於合併骨腫瘤的患者，應用PRP時亦需謹慎。PRP中所含的多種生長因子有促進腫瘤增值生長的風險。此外，高濃度PRP關節腔內注射可能會引起關節疼痛及一過性的關節功能障礙，在應用PRP治療前需要與患者進行充分溝通，取得患者的完全信任及合作。
　　PRP應用於足踝外科在國內外均剛剛起步不久，在臨床上已經展現出令人振奮的應用前景。大多數患者對PRP治療效果感到滿意。然而已發表的相關臨床研究文章數量仍十分有限，而且這些文獻中相當一部分都是經驗回顧性報道，將來尚需要進行設計嚴密的高質量大樣本隨機對照研究以進一步證實PRP的應用價值，有針對性的制定出我國PRP自體血液分離標準及足踝外科臨床應用指南，以更好服務於患者。