分化型甲狀腺癌的血清學診斷研究有哪些進展？

　　甲狀腺結節是最常見的內分泌疾病之一，其中只有5％-15％轉變成甲狀腺癌。甲狀腺癌（thyroid cancer ,TC）是最常見的的內分泌惡性腫瘤，佔全身所有惡性腫瘤的1％，佔頭頸部惡性腫瘤的91.5％[1]。分化型甲狀腺癌（DTC）約佔全部甲狀腺癌的90％以上，包括乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和濾泡狀癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）。調查顯示世界各地每年大約新增加122800例甲狀腺癌，其中PTC的發病率上升尤為明顯[2]。分化型甲狀腺癌的預後與分期密切相關，因此早期診斷有重要意義。
　　目前許多診斷技術應用於甲狀腺癌的臨床早期診斷：超聲、CT、MRI、PET/CT、細針吸取活檢(fine needle aspiration biopsy ,FNAB）。通常超聲引導下細針吸取活檢被認為是術前診斷甲狀腺癌最有效的方法，據報道FNAB有93％的敏感性和75％的特異性[3]。但是FNAB也存在侷限性：結節直徑小於１cm時，很難準確取得病變組織；細胞或組織量有限；屬於有創檢查。在不確定或懷疑惡性病變患者的術後病理發現,僅20％ ~25％為甲狀腺癌,另外75％ ~80％的患者則接受了不必要的甲狀腺手術[4]。如何通過無創手段準確而特異地早期診斷DTC一直是臨床的熱點和難點。近年來許多研究試圖通過檢測DTC患者血清中蛋白質的特異性表達改變，尋找DTC腫瘤標記物，來提高DTC早期診斷率，並且其中一些研究結果展示了良好的應用前景。
　　1、分化型甲狀腺癌無目標血清蛋白質組學研究
　　目前許多研究發現DTC存在異常基因表達，在乳頭狀癌中存在BRAFV600E基因突變、RET/PTC1 基因重排、RAS突變和TRK等[5];在濾泡狀癌中存在NRASQ61R突變、BRAFK601E突變、PAX8/PPARG 重排、RAS突變和RET/PTC 基因重排等[6]。這些突變基因不僅引起編碼蛋白髮生異常，同時還可以引起下游的相關信號通路活性改變，直接或間接影響到通路相關蛋白的翻譯及翻譯後加工修飾。尋找並分析腫瘤蛋白質差異，有可能發現DTC特異性腫瘤標誌物。目前常見的蛋白質組學技術是基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、表面增強激光解析電離飛行時間質譜（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）等。
　　蛋白質組學實驗檢查底物可以是組織也可以是血清，唾液等。Sofiadis A[7]（2010）和Becker S[8]（2012）分別應用SELDI-TOF-MS和二維凝膠電泳分析DTC組織樣本和對照組樣本之間表達的蛋白質差異，以此作為DTC診斷模型。但是組織中的蛋白差異並不等同於血清中的蛋白差異，同時腫瘤早期診斷得到的組織含量和性質都不定，容易產生假陰性結果，因此組織蛋白質組學並不適用於術前早期診斷。血清樣本豐富，臨床上血清抽取方便、快捷。血清蛋白質含量豐富（60C80 mg/ml），種類繁多（數百種）[9]。盧秀波等[10](2006)就發現甲狀腺癌、甲狀腺良性結節和健康人三組血清蛋白質表達各自有獨特的差異，並且運用血清蛋白質組學技術可以建立特異度和敏感度較高的血清蛋白質指紋圖譜模型。這表明蛋白質組學能夠分析腫瘤和良性病變血清的差異，所以血清蛋白質組學可能在腫瘤早期診斷中更具優勢。
　　自從2002年首次報道了運用蛋白質組學技術篩選出卵巢癌血清相關蛋白質標記物以來[11]，蛋白質組學技術已廣泛用於人類多種腫瘤的研究,如肺癌[12],胰腺癌[13]，卵巢癌[14],乳腺癌[15],結腸癌等[16]。迄今國內外研究者利用蛋白質組學方法對分化型甲狀腺癌患者的血清標本進行研究，篩選出一些有潛能的血清蛋白質標記物，或者建立了診斷DTC特異度和敏感度很高的血清蛋白質圖譜模型。
　　1.1  基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）
　　MALDI-TOF-MS是傳統的蛋白質分離鑑定技術。其原理是利用氮源脈衝激光使基質吸收激光的能量，從而使多肽樣品離子化。多肽樣品然後進入質量分析器,因質荷比差異發生電離,就可測量肽段離子的相關參數：肽質量指紋、肽序列標籤或部分氨基酸序列,最後用相應的軟件搜尋蛋白質組數據庫,實現對蛋白質的定性鑑定或定量分析。
　　Andrew Martorella等[17](2007)則利用MALDI-TOF-MS分析鑑定出27例甲狀腺癌和32例血清中98種有顯著差異的血清肽組成血清肽指紋圖譜，這種模型能夠以很高的統計學準確性鑑別兩個組別的血清肽差別。但是實驗發現的多肽模型並沒有進行盲選實驗，實驗結果還有待於證實，實驗方法有待於改進。隨著對蛋白質組的研究深入，新型蛋白質組學技術不斷被開發出來，表面增強激光解析電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）就是其中的代表，相比於MALDI-TOF-MS，它可以直接使用未經處理的原始樣本（比如血清、組織、體液等）進行檢測,可以大規模、超微量、高通量、全自動篩選蛋白質，還可以以不同的方式的組合蛋白質譜,進行相關疾病的診斷與研究,目前在腫瘤的基礎和臨床中研究比較廣泛。
　　1.2  表面增強激光解析電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）
　　SELDI-TOF-MS又稱蛋白質指紋技術，由蛋白質芯片、飛行質譜和分析軟件3部分組成。根據不同質荷比的蛋白質在儀器場中飛行的時間長短不一樣，被測蛋白質群在圖譜的位置取決於飛行時間並以峰的形式呈現，經計算機處理繪製形成質譜圖，直接顯示樣品中各種蛋白質的分子量和含量。通過對實驗組組與對照組的譜圖進行比較，就能發現和捕獲疾病的特異性相關蛋白質。
　　Yuxia Fan等[1]（2009）利用SELDI-TOF-MS分析並篩選出PTC患者和甲狀腺良性病變患者三個差異血清蛋白質峰：觸珠蛋白a1鏈（9190Da）、載脂蛋白C-I（6631Da）、載脂蛋白C-III（6631Da）。將觸珠蛋白a1鏈高表達，載脂蛋白C-I和載脂蛋白C-III低表達建立為PTC診斷模型，其診斷敏感度為98％。特異性為97％。另進行盲選實驗，測得PTC診斷的敏感度為95.15％，特異度為93.97％。Wang等[18](2006)和William H等[19]（2008）利用同樣方法，建立由差異蛋白質峰構成腫瘤診斷模型。其PTC診斷敏感度和特異度均在80％以上甚至達到100％。SELDI-TOF-MS技術可以精確地分析並篩選出惡性腫瘤和良性腫瘤及正常血清之間的差異的蛋白質或多肽，能夠發現它們之間細微的差別；同時血清採集、保存方便，數量足夠。其可以用於腫瘤早期診斷，尋找腫瘤特異標誌物。但是，這種方法沒有目標蛋白，測量工程大，實驗結果重複性差，還有待於進一步驗證。
　　綜上所述，以上實驗中得到的差異蛋白相差甚遠，敏感度和特異度也有不同程度的差異，這樣的數據無法在臨床應用。究其原因可以是：1，不同機構測量水平參差不齊，Alexander[20](2009)將20個高度提純的重組人蛋白髮到27個以液相色譜法為基礎的蛋白質組學研究實驗室，結果只有7個實驗室正確報道出了20個蛋白。2，血清中的蛋白質或者多肽成分和數量處於動態變化之中，這種實驗結果重複性差。無目標的檢測血清中蛋白質差異這種方法似乎行不通。
　　2、分化型甲狀腺癌蛋白質糖基化修飾異常研究
　　實際上，腫瘤的蛋白質組學研究主要包括2個方面①表達蛋白質組學（expression proteomics），側重從數量和質荷比不同篩選差異蛋白質，建立腫瘤診斷模型。②功能蛋白質組學（functional proteomics），側重在蛋白質結構、功能和作用機制水平上研究腫瘤發生和發展。所以蛋白質差異在不僅源於丰度表達差異，還反應在蛋白質合成後的修飾，包括磷酸化、糖基化、乙酰化[21]等。其中糖基化修飾是蛋白質最重要的翻譯後修飾方式之一，也是科研中研究最多的。
　　蛋白質糖基化是寡糖片段和氨基酸的側鏈共價連接在一起，隨後具有一定氨基酸排列順序的多肽鏈進一步摺疊形成一定空間結構的蛋白質分子，是蛋白質翻譯後重要的修飾之一，真核細胞中有2/3的蛋白質是糖基化修飾的。蛋白質的糖基化類型主要有兩種：一種是N-糖基化，即寡糖片段共價連在含有天冬醯胺（Asn）的側鏈上，N-糖基化普遍發生在細胞外環境的蛋白質中, 包括膜蛋白、分泌蛋白和體液中蛋白；另一種為O-糖基化，即寡糖片段連在含有絲氨酸（Ser）或蘇氨酸（Thr）殘基的側鏈上[22]。
　　蛋白質糖基化參與調節細胞許多生理和病理事件，比如細胞生長，遷徙，分化和腫瘤轉移等。細胞膜表面糖蛋白位於細胞最外層，溝通著細胞內外環境，參與了受體激活、信號轉導等諸多重要的生物進程[23]。真核細胞中有2/3的蛋白質是糖基化修飾的，細胞表面很多受體屬於糖蛋白，如EGFR、整合素和TGFBR都屬N-糖基化修飾[21]。
　　Arcinas[24]在2009年比較分析了5個不同的人類甲狀腺癌細胞系細胞表面蛋白和分泌蛋白的表達譜，一共鑑定出333個糖基化修飾蛋白。在對分化型甲狀腺癌細胞系（TPC-1，FTC-133）的研究中，細胞膜蛋白、肉毒素、細胞粘附分子-1、滋養層細胞糖蛋白和盤狀整合素α-5 蛋白鏈這五種蛋白只表達於DTC中。Miyoshi等[21]（2010）更進一步證實在分化型甲狀腺癌的糖基化修飾腫瘤細胞中，糖基化修飾轉移酶FUT8在早期明顯上調，GnT-V在後期表達中明顯上調。
　　從上述研究中可以看出，甲狀腺組織細胞蛋白存在糖基化修飾增強。目前研究還發現在肝細胞癌（N-乙酰葡糖胺基轉移酶V，GnT-V；N-乙酰葡糖胺基轉移酶III，GnT-III；α1-6墨角藻糖基轉移酶,α1-6FT）[25]、乳腺癌（N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶V ，GnT-V）[26]和前列腺癌（B-結合珠蛋白）[27]患者的血清中存在蛋白糖基化修飾異常。Hidenori[28]在甲狀腺癌患者血清中檢測到Galectin-3的表達。目前分化型甲狀腺癌血清蛋白糖基化修飾在早期診斷研究較少，但這種方法還是展現一定的發展前景，提供了新穎的研究思路，比如可以篩選幾種DTC差異糖基化蛋白並結合特異性較強的甲狀腺球蛋白作為診斷模型，所以分化型甲狀腺癌蛋白質糖基化修飾異常研究還需要進一步研究。
　　結論和展望
　　綜上所述，分化型甲狀腺癌血清學早期診斷研究尚處於實驗階段。無目標血清蛋白質組學研究提供了很清晰的研究思路，但是血清蛋白質組學至今還沒有應用於分化型甲狀腺癌的臨床早期診斷，究其原因有以下幾點：1，仔細分析上述血清學檢測結果，可以看出不同研究機構所得差異蛋白相差甚遠，實驗數據重複性差，無法臨床應用[20]。2,血清蛋白質的99％是由22種高分子量蛋白組成，比如：白蛋白，轉鐵蛋白，結合球蛋白等；剩餘的1％才是由數百種低分子量蛋白質組成的。血清中蛋白質數量種類繁多，並且常處於動態變化之中[9]。目前傳統的試圖通過無目標的血清/血漿的低丰度小分子肽來尋找腫瘤標誌物這種方法似乎行不通。3，一味地研究蛋白質數量的改變。正常組織和腫瘤組織因基因改變產生的差異都要反應到蛋白上，但蛋白的功能差異在不僅源於丰度表達差異，更多在蛋白質合成後的修飾，包括磷酸化、糖基化、乙酰化等。隨之分化型甲狀腺癌蛋白質修飾方面研究開始起步發展，尤其是分化型甲狀腺癌特異性糖基化蛋白質的研究，上述研究中可以看出，甲狀腺組織細胞蛋白存在糖基化修飾增強，但是甲狀腺癌的血清/血漿蛋白糖基化修飾異常研究較少，還需更進一步開展。