骨髓增殖性腫瘤中的CALR突變

　　2005年隨著費城染色體陰性（PH-）骨髓增生性腫瘤（MPNs）患者中發現JAK2V617F突變，MPNs診斷已取得重要進展，在其發病機制涉及JAK / STAT通路，並已作為一種新的靶向治療。儘管如此，大約三分之一非JAK2或MPL突變的原發性血小板（ET）以及原發性骨髓纖維化（PMF）的患者是否存在突變當時仍然是未知的。直到2013年底，兩項使用全外顯子測序方法的研究確定了編碼鈣網蛋白（CALR）的重現性基因突變。這種突變出現在大多數非JAK2或MPL突變的ET和PMF患者中，但真性紅細胞增多症（PV）患者不出現。CALR基因（最後一個外顯子編碼蛋白質鈣網蛋白的C-末端氨基酸）的外顯子9的體細胞52-bp缺失（1型突變）和重現性5-bp的插入（2型突變）被檢測到，並總是發現其產生移碼突變。所有檢測到的突變體鈣網蛋白共享在C-終端的新的氨基酸序列。CALR突變在疾病的克隆早期獲取，並且導致JAK / STAT激活。CALR突變是MPNs患者中繼JAK2V617F突變後第二個最常見的基因突變，他們的檢測已顯著改善了ET和PMF的診斷方法。本文著重討論CALR突變的特點以及其在本病的診斷、臨床和發病機制中的影響。
　　經典的費城染色體陰性（PH-）骨髓增殖性腫瘤（MPNs）包括真性紅細胞增多症（PV），原發性血小板增多症（ET）和原發性骨髓纖維化（PMF）。在2005年，JAK2V617F突變的發現，JAK / STAT通路激活引起的MPNs取得了重大的進步JAK2V617F突變出現在於95％的PV，50％的ET和60％的PMF病人。隨後發現其他兩個突變（JAK2外顯子12和血小板生成素受體的基因突變，骨髓增生性白血病，MPL）也直接影響這一途徑。在JAK2外顯子12突變存在於2％的PV患者；對MPL突變存在於非JAK2突變的5％的ET和10％的PMF病人。觀察MPNs的體細胞突變，其它基因如TET2，ASXL1，DNMT3A和EZH2被發現在JAK2和MPL突變的患者中，且其出現是非特異的。直到最近，在大約三分之一的非JAK2或MPL突變的ET和PMF，使動突變並沒有得到認可。2013年，由Klampfl和Nangalia研究確定在非JAK2或MPL突變患者中出現重現性編碼鈣網蛋白（CALR）的基因突變，及其在MPNs發展中的作用。進一步的研究觀察CALR突變在MPNs發病中的作用，並且已經報道了和這些突變的臨床相關性的作用。
　　CALR突變的發現
　　Klampfl等用外顯子測序檢測6例JAK2和MPL陰性的PMF外周血粒細胞的DNA（腫瘤樣品）和匹配的CD3+ T淋巴細胞的DNA（對照樣品）。每名患者的2-12的體細胞突變被發現，只有CALR（位於染色體19p13.2，含有9個外顯子，編碼鈣網蛋白）基因是重現性的。兩例有體細胞缺失，4例患者有重現性的5-bp的插入CALR的外顯子9中（編碼蛋白質的C末端氨基酸）。
　　PCR檢測896例MPNs患者的CALR外顯子9的插入和缺失突變。PV患者均未發現CALR突變。25％的ET和35％的PMF患者檢測到CALR突變。所有CALR突變的患者均為非JAK2和MPL突變（CALR突變與JAK2和MPL突變是相互排斥的）。
　　少於10％ET或PMF的患者JAK2、MPL和CALR突變均為陰性。已經報道了一些研究分析MPN的CALR突變，10％-23％ET患者報告三陰性（JAK2，MPL和CALR突變陰性）。
　　Nangalia等用外顯子組測序的方法檢測了151例MPN樣本。在31例非JAK2或MPL突變的ET或PMF中26例CALR體細胞突變陽性。
　　JAK2V617F和CALR外顯子9的突變被認為是相互排斥的。然而已經報道了3例（2例ET和1例PMF）的雙突變（JAK2V617F和CALR突變）。雙突變的真實頻率，致病性和臨床意義尚不清楚。
　　其他骨髓疾病患者（急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生異常綜合徵（MDS）、慢性粒單核細胞白血病、難治性貧血伴環形鐵粒幼細胞增多伴有明顯血小板增多（RARS-T））分別檢測CALR外顯子9，3名RARS-T患者篩選有CALR突變。8％的MDS患者CALR突變性。524的健康志願者中1例存在突變。
　　檢測發現36種類型導致移碼來替代閱讀框的體細胞突變CALR（插入和刪除）。1型（52 bp缺失）和2型（5-bp的插入）CALR突變分別佔53.0％和31.7％。1型突變在PMF比ET更頻繁。其它突變類型觀察到的頻率均低得多。
　　鈣網蛋白
　　鈣網蛋白是多功能的蛋白質。在內質網中，蛋白質可確保新合成的糖蛋白的適當摺疊和調節鈣動態平衡。鈣網蛋白也存在於細胞內、細胞表面和胞外區室，在那裡它已經牽涉到許多生物過程，包括增殖、凋亡和免疫原性細胞死亡。
　　鈣網蛋白有三個主要的結構和功能結構域：N-末端凝集素結合結構域，一個富含脯氨酸P域，幷包含多個鈣結合位點的C末端的酸性結構域。鈣網蛋白包含內質網在C-末端滯留基序（KDEL基序）。該KDEL基序出現在一些內質網的蛋白質，使這些蛋白質從高爾基體回到內質網。
　　伴有C末端改變的CALR蛋白突變體
　　所有檢測到的CALR蛋白突變體共享一個在C-末端新的氨基酸序列。非突變CALR C-末端主要是帶負電荷的，而CALR突變C-末端包含許多帶正電荷的氨基酸。1型突變消除幾乎所有的帶負電荷的氨基酸，而2型突變保留約一半的帶負電荷的氨基酸。由於鈣網蛋白的負電荷的C-末端結構域是低親和性、高容量、鈣離子結合結構域，鈣離子結合性的蛋白突變體的功能可能被削弱。此外，KDEL基序在C-末端是失去了在所有的突變體。因此，突變型鈣網蛋白可具有改變的亞細胞定位。
　　調查是否在CALR突變患者的克隆細胞史早期或晚期，分析MPN患者獲得的造血前體細胞克隆，結果發現，CALR突變主要出現在早期克隆。
　　CALR突變在MPN中的致病作用
　　非突變和1型突變CALR分別轉入IL-3依賴性鼠細胞系。表達1型CALR突變細胞顯示增長，它不依賴於IL-3且對IL-3敏感。表達非CALR突變或1型突變CALR的細胞對JAK2激酶抑制劑顯示類似的敏感性，這表明依賴IL-3生長的CALR突變細胞依賴於JAK2或JAK家族激酶。為了證實該假說，檢測存在或不存在IL-3的對照和CALR轉染細胞系中的STAT5磷酸化。在不存在IL-3的和在低濃度IL-3的1型突變CALR細胞，但不是在非突變CALR細胞中檢測STAT5的磷酸化增加。這些發現支持的假設激活1型CALR突變的JAK / STAT信號。
　　家族性MPN
　　儘管大多數的MPN都是散發的，家族性MPNs（至少2名成員患有MPN）有很好的描述。家族成員MPN可能有獲得性的體細胞突變。相信患者的家族MPN繼承“易感性”源於MPN的體細胞突變。一項研究發現21例家族性MPNs中兩名成員有CALR突變，表明這些基因突變也可發生在家族性病例。
　　MPN患者CALR突變的臨床相關性
　　CALR突變與低齡、男性ET患者和低齡化的PMF 患者相關。
　　血細胞計數
　　ET的患者中，診斷時那些具有CALR突變患者比JAK2突變患者有較低的血紅蛋白水平、較低的白血細胞（WBC）計數和較高的血小板計數。JAK2V617F突變患者比CALR突變患者與有較低血清促紅細胞生成素。
　　PMF患者中，診斷時那些具有CALR突變患者比突變JAK2有較低的WBC和更高的血小板計數。單因素分析254例PMF，CALR突變與較高的血小板計數有關（P<0.0001），CALR突變患者貧血和白細胞增多相對較輕。
　　血栓風險
　　ET患者中，有CALR突變者血栓發生率低於JAK2 突變。144例內臟靜脈血栓形成（SVT）風險的比較隊列研究中，JAK2V617F突變者的發生率為18.8 ％；CALR外顯子9的突變患者均未發生。這一發現支持CALR突變患者與JAK2突變的風險相比血栓的發生較低。
　　紅細胞增多轉化
　　15年的隨訪發現，紅細胞增多患者沒有CALR突變，JAK2突變ET累積風險是29％。
　　骨髓纖維化轉化
　　根據體細胞突變狀態，轉化為骨髓纖維化的發生率（MF）仍有爭議。在一項研究中，CALR突變患者從ET為MF轉化的發生率比JAK2 突變者顯著增高。在其他研究中，兩個組之間MF轉化的發生率沒有顯著差異。
　　總體生存
　　Klampfl等的多變量分析研究表明，JAK2和MPL突變MPN患者死亡高於CALR 突變。Nangalia等報道兩個不同ET突變組之間沒有明顯的生存差異。在一項隊列研究觀察576例ET患者的結果顯示CALR突變不影響生存。另一有關CALR突變對ET長期生存在影響的研究，觀察了2006年以前診斷的299例患者，結果顯示生存期最短的是MPL突變患者。JAK2患者的中位生存期為19年而CALR突變20年（P =0.32）。這項研究的獨特特點是很長的隨訪時間，提供了ET長期生存的準確估計，並補充了關於特定突變表型和預後的最新信息。
　　在PMF，CALR突變對生存是有利的，獨立於動態國際預後評分系統（DIPSS）和ASXL1突變狀態。三陰性的患者顯示白血病轉化更少。這些發現提示“CALR（ - ）/ ASXL1（+）”和“三陰性”為PMF的高風險分子特徵。在隨後的研究中，570例 PMF患者推導（N =277）和驗證（N =293）用於CALR和ASXL1突變分子預後觀察。生存期最長的是CALR（+）/ ASXL1（ - ），最短的是CALR（ - ）/ ASXL1（+）。CALR/ ASXL1預後模型是獨立於DIPSS的，能有效地識別低中危-1-組患者和高中危-2-組患者生存期。
　　ET和PMF診斷和治療的現狀
　　在JAK2V617F突變發現後短短几年的MPN診斷取得了長足的進步。新發現的一個重要後果是導致世界衛生組織（WHO）對這些疾病的分類和診斷的修改。JAK2陽性MPN患者共享某些特徵，但目前可用的數據不能牢固支持JAK2突變與否的分類管理，因此WHO分類仍然作為臨床實踐使用的診斷工具。CALR突變的發現是我們對MPNs的發病機制的認識又一個里程碑。對CALR突變評估顯著改善了ET和PMF的診斷方法。疑是ET或PMF，最初的突變篩查應從JAK2V617F開始，JAK2V617F陰性再行CALR突變篩查。CALR突變陰性者篩選MPL突變。三陰性是上述三種突變檢測均為陰性的患者。CALR突變應列入MPN診斷並整合入後續版本WHO分類體系。與JAK2V617F突變類似，目前試圖根據JAK2/ MPL/ CALR突變進行分子診斷仍言之過早，但可能預示MPN的未來。
　　原發性血小板增多症患者在血栓形成併發症，CALR突變與JAK2突變相比風險較低，然而目前尚未實施基於突變狀態的治療修改建議。在兩例CALR突變原發性血小板增多症患者中，用α干擾素導致持續血液學完全反應，維持治療的停藥後，等位基因突變體的負荷在繼續減少，這表明α干擾素可以通過CALR突變靶向治療細胞，治療反應是持續的。ruxolitinib治療PMF的兩項臨床試驗結果表明，這個JAK1和JAK2抑制劑在大多數患者是有效的，無論其是否存在JAK2V617F 突變。事實上，絕大多數患者的非JAK2突變均有CALR突變，這意味著ruxolitinib對CALR突變患者也是有效的。依據CALR和ASXL1突變的分子預後模型，不僅DIPSS加高風險性骨髓纖維化應幹細胞移植，CALR（ - ）/ ASXL1（+）突變狀態下的任何風險程度疾病。需要更多的研究來驗證“CALR（ - ）/ ASXL1（+）”突變與“三陰性”考慮預後差的PMF。我相信，在未來骨髓纖維化的風險分層評分中，突變的資料將被集成，這將有利於選擇高風險患者進行異體移植。
　　展望
　　目前仍需要更多的資料才能理解CALR突變在本病的產生和進展過程中的作用。從CALR突變的C-末端結構域的替代讀框獲得的肽序列代表了癌症特異性表位，這為我們提供了用於免疫治療靶的機會。